1、Hepcidin是一種由肝臟表達的富含半胱氨酸殘基的小分子肽，對于調節(jié)機體鐵離子代謝平衡發(fā)揮著重要作用。與許多富含半胱氨酸的抗菌肽類似，hepcidin同樣具有廣譜的抗菌作用。本文對構建的分泌表達人hepcidin巴斯德畢赤酵母重組pPICZα A-Hepc菌株的高表達發(fā)酵條件進行優(yōu)化，研究了重組人-hepcidin的純化工藝，通過抑菌及小鼠內皮細胞的轉染實驗證實酵母表達重組人-hepcidin25具有抗微生物活性及調節(jié)細胞內鐵代謝活性

2、。 巴斯德畢赤酵母作為外源蛋白表達系統(tǒng)有很多優(yōu)點，但也有其不足之處，比如產量普遍較低。提高產量，除了可選用強啟動子，使用酵母偏愛的密碼子及外源基因高拷貝整合等方法，在發(fā)酵過程中控制生物反應狀態(tài)，使細胞生長至高的密度并使細胞生理狀態(tài)維持高的活力，以獲得盡可能多的產品也至關重要。針對這一問題，本文優(yōu)化巴斯德畢赤酵母發(fā)酵培養(yǎng)基的組成以及培養(yǎng)條件，考察了不同培養(yǎng)基C源N源對細胞生長及外源基因表達的影響。在搖瓶中，對發(fā)酵條件進行了研究．發(fā)

3、現(xiàn)較適合的培養(yǎng)條件為：基礎發(fā)酵培養(yǎng)基以葡萄糖20g/L為碳源，蛋白胨20g/L，0．1mol/L磷酸鉀緩沖，起始pH6．0，250 ml搖瓶裝液量25ml，生物素4×10-4g/L，YNB13．4g/L（同比總體積量分批加入誘導培養(yǎng)基），甲醇誘導濃度0．5%，發(fā)酵3d后，目的蛋白產量可達150mg/L。 對重組畢赤酵母（Pichia pastoris）分泌至胞外存在于發(fā)酵液的hepcidin進一步分離純化，選用等電沉淀，硫酸銨分

4、級沉淀，陰離子交換層析，陽離子交換層析，凝膠過濾純化，反相色譜純化等步驟，確定純化工藝為等電沉淀，凝膠分子篩層析，反相色譜精純，得到的目的蛋白電泳檢測樣品呈現(xiàn)單一條帶，純度不低于90%。質譜分析重組hepcidn分子量與計算一致，CD光譜證實重組hepcidin結構與天然類似。 通過抑菌實驗、轉染小鼠內皮細胞w estern blot檢測胞內GFP-FPN1及TfR1的變化測定重組hepcidin的生理活性。研究發(fā)現(xiàn)重組hepc