1、血栓性疾病是嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一，而利用溶栓劑治療血栓病的溶栓療法被認(rèn)為是最為有效的方法。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界每年有血栓栓塞性病人約1700萬(wàn)，所需的溶栓劑的潛在市場(chǎng)約20億美元。因此，尋找和研制新型、高效、安全的溶栓藥物并實(shí)現(xiàn)高效高活性表達(dá)，對(duì)于更有效地治療血栓性疾病具有十分重要的意義。 Fibrolase是來(lái)自美國(guó)銅頭蝮蛇毒的一種鋅金屬蛋白酶，具有纖溶活性而無(wú)出血活性。Alfimeprase(ALF)是Fibrolase的N

2、端突變體體(前3個(gè)氨基酸EQR曲Ser取代)，與Fibrolase具有同樣的溶栓功能，由美國(guó)Nuveo公司研制開(kāi)發(fā)并申請(qǐng)了專利，其Ⅰ期關(guān)于治療慢性周?chē)鷦?dòng)脈血栓(PAO)和Ⅱ期關(guān)于治療周?chē)o脈導(dǎo)管栓塞病(CVAD)的臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，ALF不僅是一種直接快速呈劑量相關(guān)的溶栓劑，而且很有希望成為第一個(gè)快速、高效、安全的蛇毒基因工程溶栓藥物，現(xiàn)已開(kāi)始用于治療急性PAO和CVAD的Ⅲ期臨床試驗(yàn)。 由于畢赤酵母(P. pastoris)表

3、達(dá)系統(tǒng)是目前較完善的高效異源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，具有高分泌表達(dá)、高穩(wěn)定整合、易于高密度發(fā)酵和產(chǎn)物的下游純化等優(yōu)點(diǎn)，所以本研究采用該系統(tǒng)對(duì)ALF的高效高活性表達(dá)進(jìn)行了研究。研究通過(guò)雙酶切從構(gòu)建好的克隆載體p43-alf上獲取目的基因his6-alf,將其克隆至畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pPIC9K和pPICZα A，經(jīng)高效電轉(zhuǎn)化、篩選鑒定、甲醇誘導(dǎo)表達(dá)獲得了重組ALF(rALF)高表達(dá)菌株GS115/pPIC9K-his6-alf,KM71/pPI

4、C9K-his6-alf和GS115/pPICZα A-his6-alf. SDS-PAGE和Western blotting分析表明rALF的分子量約為23.8 kDa，且能與小鼠抗His·tag的單克隆抗體特異結(jié)合，這說(shuō)明rALF獲得了特異表達(dá)。通過(guò)對(duì)培養(yǎng)條件pH、每天甲醇流加終濃度、菌體生長(zhǎng)密度和誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化，三種重組菌中rALF的表達(dá)量分別高達(dá)510 mg/L、465 mg/L和425 mg/L。同時(shí)可見(jiàn)pPIC9K-his6

5、-alf組菌中KM71重組菌比GS115重組菌表達(dá)的rALF更純，而GS115重組菌單位體積表達(dá)液中rALF的表達(dá)量更大。三種重組菌的優(yōu)化表達(dá)液經(jīng)His·bina柱純化后，rALF純度分別高達(dá)94.8％、96％禾1195％。纖維蛋白平板法纖溶活性鑒定結(jié)果表明rALF獲得了高活性分泌表達(dá)，且其纖溶活力呈現(xiàn)出劑量相關(guān)性和時(shí)間依賴性。另外，rALF的電泳檢測(cè)和混合纖溶活性測(cè)定分析結(jié)果顯示：對(duì)于rALF的高效高活性分泌表達(dá)而言，pPIC9K載體