1、菊粉酶是一類是能水解13-2,1-D-果聚糖果糖苷鍵的水解酶,屬于GH32糖苷水解酶家族,菊粉酶在微生物和植物中廣泛存在。上個世紀20年代,科學家發(fā)現某些微生物能發(fā)酵菊芋,1991年成功利用分子生物學方法克隆得到菊粉酶基因。此后菊粉酶的功能、性質、結構引起了研究人員的興趣。但是至今研究還未完全揭示菊粉酶蛋白所有性質和結構特征。菊粉酶根據水解菊粉方式不同,分為內切菊粉酶和外切菊粉酶,它們分別水解菊粉得到的低聚果糖和果糖,兩種產品在工業(yè)生產

2、中都有應用。利用基因工程手段將菊粉酶基因在畢赤酵母中表達并高密度發(fā)酵生產得到高濃度的菊粉酶蛋白是生產低聚果糖和果糖的有效方法,能降低成本,提高利用率。本論文首先通過引物設計從馬科斯克魯維酵母染色體上克隆得到包括INU1基因ORF在內的菊粉酶基因大片段,再以大片段基因為模板擴增INU1基因的ORF。利用‘TA’克隆將INU1片段與pEASY T3載體連接,構建了在大腸桿菌中復制的pEASY T3-INU1重組載體。利用限制性內切酶切重組T

3、3-INU1載體和pPIC9載體,得到有相同粘性末端的INU1片段和線性的pPIC9,利用連接酶將兩片段連接,構建了能在大腸桿菌和畢赤酵母中復制表達的穿梭質粒pPIC9-INU1。論文第二部分是將線性化的pPIC9-INU1載體通過電轉化的方法轉移至畢赤酵母中,利用載體5’AOX基因與畢赤酵母染色體上5’AOX基因的同源性,將其同源重組。重組轉化子含有HTS4基因,能在無組氨酸的培養(yǎng)基中生長,利用組氨酸營養(yǎng)缺陷型篩選畢赤酵母重組轉化子。

4、PCR驗證陽性轉化子。實驗利用甲醇作為唯一碳源和誘導劑,誘導轉化子表達重組菊粉酶蛋白。濃縮發(fā)酵液上清中的蛋白,利用SDS-PAGE電泳檢測發(fā)酵液中蛋白表達情況,實驗結果顯示,轉化子能大量表達重組酶蛋白,并利用載體自身的信號肽將蛋白分泌到細胞外。利用DNS方法檢測重組酶活性,搖瓶發(fā)酵轉化子產酶量不斷提高,在163h時酶活性達到峰值,達到10.168U,將4號轉化子接種到5L發(fā)酵罐中培養(yǎng),酶活達到12.458U/ml。菌體OD600達到39