1、纖維素是自然界中分布最廣、含量最多的一種有機(jī)化合物，占植物干重的1/3～1/2，是世界總量最大的可再生資源，合理地開發(fā)與利用纖維素資源對(duì)于緩解能源危機(jī)、糧食短缺、環(huán)境污染等問題具有十分重要的意義。利用微生物及其產(chǎn)生的纖維素酶來分解纖維素是一種有效且無污染的方法。纖維素酶是降解纖維素的高活性生物催化劑，廣泛用于飼料、環(huán)保、食品、釀酒、紡織、造紙等領(lǐng)域。但天然的微生物生產(chǎn)纖維素酶存在酶產(chǎn)量低、活性低、受到葡萄糖等產(chǎn)物的反饋抑制等許多問題，這

2、些問題極大地影響了纖維素酶的工業(yè)化生產(chǎn)。應(yīng)用基因工程技術(shù)來獲得高活力、高產(chǎn)量的纖維素酶資源越來越受到人們的重視。
　　 纖維素外切酶是纖維素水解酶系中唯一可以作用于結(jié)晶纖維素的酶組分，對(duì)纖維素的降解有著重要的作用。本實(shí)驗(yàn)從纖維素酶高產(chǎn)菌康氏木霉(Trichodermakoningii)的染色體DNA中擴(kuò)增得到外切葡聚糖酶CBHⅠ基因，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pGAPZαA-CBHⅠ并通過高壓電擊手段轉(zhuǎn)入到畢赤酵母(Pichiapasto

3、ris)X-33中實(shí)現(xiàn)了CBHⅠ基因在畢赤酵母中的表達(dá)。
　　 主要內(nèi)容包括以下：
　　 采用PCR技術(shù)擴(kuò)增得到CBHⅠ基因，與克隆載體PMD19-T連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，測(cè)序及序列比對(duì)結(jié)果顯示該DNA序列全長1626bp，與Genbank已公布的Trichodermaviride(FJ871063.1)的同源性達(dá)到99.63％，推測(cè)其編碼的蛋白質(zhì)含497個(gè)氨基酸，分子量約為52.29kDa，蛋白質(zhì)等電點(diǎn)pI=4.

4、28。
　　 將CBHⅠ基因與表達(dá)載體pGAPZαA連接后，通過過渡宿主大腸桿菌再轉(zhuǎn)化到畢赤酵母X-33中，將經(jīng)過鑒定的重組酵母菌株接種于YPD液體培養(yǎng)基，定時(shí)取樣進(jìn)行纖維素酶活性測(cè)定與SDS-PAGE蛋白電泳檢測(cè)，并對(duì)其產(chǎn)酶性質(zhì)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示：重組酵母菌發(fā)酵培養(yǎng)液羧甲基纖維素酶活力最高達(dá)到1.1798U/mL，微晶纖維素酶活力最高達(dá)到0.1276U/mL，SDS-PAGE蛋白電泳顯示表達(dá)蛋白的分子量約為53kDa。結(jié)果表明