1、纖維素是自然界中含量最多的一種有機(jī)化合物。開展纖維素酶生物學(xué)研究是深入了解纖維素的代謝機(jī)制和利用纖維素的基礎(chǔ)，特別是在利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)生物乙醇方面，具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。本實(shí)驗(yàn)從里氏木霉(Trichoderma reeseri)中克隆纖維素酶基因，并在水稻中進(jìn)行過量表達(dá)研究，獲得如下主要結(jié)果。
　　 1．依據(jù)發(fā)表在GenBank中的基因序列，利用RT-PCR方法，從里氏木霉(Trichoderma reeseri)的c

2、DNA中克隆到了完整的內(nèi)切B-1，4-葡聚糖酶V(Endo-B-1，4-glucallaseV)，內(nèi)切B-1，4-葡聚糖酶Ⅳ(Endo-B-1，4-glucallaseIV)以及外切B-l，4-葡聚糖酶I(B-l，4-glucancellobiohydrolasel)蛋白質(zhì)編碼區(qū)(codingsequence region，CDS)的cDNA。
　　 2．克隆到的里氏木霉EGV基因蛋白質(zhì)編碼區(qū)全長726bp，編碼242個氨基酸。

3、核酸序列與已發(fā)表的里氏木霉AS3.3711菌株的EGV蛋白質(zhì)編碼區(qū)cDNA序列相比有一個核苷酸的突變，推導(dǎo)的氨基酸序列也有一個氨基酸的突變，但是沒有明顯影響到蛋白質(zhì)的活性。
　　 3．克隆到的里氏木霉EGIV基因蛋白質(zhì)編碼區(qū)cDNA全長1032bp，編碼344個氨基酸，CBHI基因蛋白質(zhì)編碼區(qū)cDNA全長1542bp，編碼514個氨基酸。所獲得的EGIV基因和CBHI基因核酸序列和已發(fā)表的里氏木霉EGIV基因和CBHI基因的蛋白

4、質(zhì)編碼序列相比完全一致。
　　 4．將EGV基因插入到雙T-DNA載體pDTB中，構(gòu)建載體pDTB-HA-EGV。將合成的定位于質(zhì)體的信號肽Apo-SP插入到載體pDTB-HA-EGV中，構(gòu)建載體pDTB-Apo-HA-EGV，并且通過紅色熒光蛋白在洋蔥表皮細(xì)胞的瞬時表達(dá)驗(yàn)證該信號肽的功能。
　　 5．用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法對水稻品種中花11進(jìn)行轉(zhuǎn)化，分別獲得轉(zhuǎn)化pDTB-HA-EGV載體的68個植株和轉(zhuǎn)化pDTB-Apo-

5、HA-EGV載體的97個植株。PCR檢測和Southern雜交分析轉(zhuǎn)基因植株，表明目的基因和抗除草劑基因均整合到水稻基因組中。通過對轉(zhuǎn)基因水稻T1代30個株系共計291棵植株的PCR檢測，僅含目的基因的轉(zhuǎn)基因植株27棵，占9.28％；僅含篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植株20棵，占6.87％。結(jié)果表明使用雙T-DNA載體共轉(zhuǎn)化法去除轉(zhuǎn)基因植物分子標(biāo)記的策略有明顯的效果。
　　 6．通過Western雜交檢測到兩個轉(zhuǎn)基因株系的T0代干枯秸稈和T