1、目的：
　　明確自噬與非小細胞肺癌吉非替尼獲得性耐藥的相關(guān)性，同時闡明調(diào)控靶點HMGB1在自噬介導(dǎo)的吉非替尼NSCLC獲得性耐藥中的關(guān)鍵作用，以及Bcl-2和Beclin-1信號通路與HMGB1及吉非替尼NSCLC獲得性耐藥的關(guān)系。
　　方法：
　　1.在吉非替尼敏感NSCLC細胞系PC9（EGFR19外顯子缺失）上，經(jīng)吉非替尼處理不同時間，構(gòu)建吉非替尼獲得性耐藥細胞株P(guān)C9-R（EGFR T790M、Met擴增均為陰

2、性）。通過AO染色檢測酸性囊泡、Western blot檢測耐藥過程不同階段自噬標志蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ、p62(SQSTM)表達，明確在吉非替尼獲得性耐藥與自噬的相關(guān)性。
　　2.采用小分子RNA干擾技術(shù)/脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，構(gòu)建沉默/過表達HMGB1的PC9細胞，以不同濃度吉非替尼處理后，MTT法檢測考察抗腫瘤活性，Western blot檢測自噬標志蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ、p62表達，免疫組化法檢測LC3Ⅰ/Ⅱ的分布，明確HMGB1對自噬

3、調(diào)控及吉非替尼獲得性耐藥的影響。
　　3.針對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路HMGB1/B eclin和MAPK/Bcl2/HMGB1，以Western blot為檢測吉非替尼獲得性耐藥中Beclin-1、Bcl2、pJNK、pERK和p38表達的變化，考察自噬誘導(dǎo)的吉非替尼獲得性耐藥中HMGB1與Beclin-1和Bcl2的相互作用和結(jié)合情況。
　　結(jié)果：
　　1.吉非替尼耐藥過程中，自噬標志蛋白LC3發(fā)生Ⅰ型向Ⅱ型的轉(zhuǎn)化、p62表達

4、下降，表明吉非替尼獲得性耐藥過程中出現(xiàn)自噬。采用自噬抑制劑氯喹以及RNA干擾阻斷技術(shù)調(diào)控自噬水平，通過MTT法檢測發(fā)現(xiàn)抑制自噬的發(fā)生可以明顯增加吉非替尼的抗腫瘤活性，證明自噬介導(dǎo)吉非替尼獲得性耐藥的發(fā)生。
　　2.在構(gòu)建的吉非替尼獲得性耐藥細胞株P(guān)C9/R中，耐藥過程中HMGB1的表達明顯上調(diào);沉默HMGB1的表達，吉非替尼的抗腫瘤活性明顯增強，表明HMGB1參與吉非替尼獲得性耐藥的發(fā)生。另外，在沉默HMGB1表達后自噬標志蛋白L

5、C3Ⅰ型向Ⅱ型轉(zhuǎn)變減少、p62的下調(diào)被逆轉(zhuǎn)，證明HMGB1通過介導(dǎo)自噬過程發(fā)揮調(diào)控吉非替尼獲得性耐藥。
　　3.吉非替尼獲得性耐藥中Beclin-1以及pBcl2表達上調(diào)，Bcl2表達減少;抑制Beclin-1能明顯增強吉非替尼的抗腫瘤效果，說明Beclin-1參與吉非替尼獲得性耐藥的發(fā)生。在自噬誘導(dǎo)的吉非替尼獲得性耐藥中HMGB1與Beclin-1的結(jié)合明顯增多，促進自噬介導(dǎo)的吉非替尼獲得性耐藥的發(fā)生。
　　結(jié)論：