1、腫瘤細胞群體中具有自我更新能力和分化潛能的小部分腫瘤細胞被稱之為腫瘤干細胞（Cancer Stem Cells，CSCs），它是腫瘤發(fā)生、增殖、轉移和治療抵抗的“種子細胞”，臨床證據也顯示腫瘤干細胞可能是腫瘤演進的根源。腫瘤干細胞的發(fā)現和證實為腫瘤的高效治療提供了新的契機，促使我們重新考察傳統(tǒng)的惡性腫瘤治療策略。因此，靶向腫瘤干細胞的特異性殺傷有望為改善惡性腫瘤療效帶來新的希望，而用于分離和鑒定腫瘤干細胞的特異性標記為高效的主動靶向提供

2、了潛在位點?；诖?，本文提出利用篩選腫瘤干細胞的特異性抗體構建抗體-藥物偶聯物（Antibody-drug conjugate, ADC）靶向性殺傷腫瘤的策略，以期極大地提高腫瘤治療效果。
　　本課題以結腸癌為例，選用可抑制微管組裝而影響細胞有絲分裂的強細胞毒素阿里他汀（Auristatins）的衍生物Monomethyl Auristatin F（MMAF）作為ADC的偶聯藥物；選用結腸癌干細胞表面的特異標記CD133分子的抗體

3、AC133作為偶聯抗體，構建靶向結腸癌干細胞的抗體偶聯藥物。合成、純化和表征ADCs藥物AC133-L1-MMAF（L1：Maleimidocaproyl-val-cit-pABC）后，以CT-26細胞為研究對象，體外分析評價AC133-L1-MMAF對CD133+細胞的主動靶向性和細胞毒性；構建CB-17/SCID小鼠體內移植瘤模型，評價ADC體內抗腫瘤活性。通過本課題的研究，不僅能為腫瘤治療提供全新的策略，還能為針對腫瘤細胞不同分化

4、型態(tài)給藥提供實驗和理論依據。
　　本課題主要內容和結果有：
　?、龠x用小鼠結腸癌干細胞上的標記物CD133抗體anti-CD133（AC133）作為偶聯抗體，以細胞微管類毒素藥物阿里他汀的衍生物MMAF作為偶聯藥物，以maleimidocaproyl-val-cit-pABC作為鏈接子，合成抗體偶聯藥物AC133-maleimidocaproyl-val-cit-pABC-MMAF（AC133-L1-MMAF）；通過SDS-

5、PAGE、RP-HPLC等表征AC133與L1-MMAF偶聯。SDS-PAGE實驗結果表明，單抗AC133在連接上MMAF之后分子量增大；RP-HPLC結果表明：在單抗AC133的特征吸收波長280nm處出現兩個吸收峰，查閱文獻得知依次為抗體的輕鏈和重鏈，在MMAF的最大吸波長220nm處并無吸收峰出現，而ADC在220nm和280nm處均檢測到吸收峰，出峰時間相近。由以上結果可說明 AC133與L1-MMAF連接成功；
　　②以

6、小鼠結腸癌細胞CT-26為研究對象，通過MTT法檢測ADC、DOX和L1-MMAF對CT-26細胞的毒性。實驗結果表明，給藥72h后ADC的IC50值為0.182±0.004nM，而72h后L1-MMAF的IC50值為2.642±0.179uM，DOX為8.986±0.163uM，與L1-MMAF和DOX比較，統(tǒng)計學差異顯著，表明ADC對CT-26/CD133+細胞有更強的毒性；以相同濃度的 ADC、DOX和L1-MMAF處理CT-26

7、/CD133+細胞和鼠嗜鉻細胞瘤細胞pc12/CD133-細胞發(fā)現，ADC對CD133+細胞有更強的毒性；通過免疫熒光標記法分別檢測ADC-AF488對未被飽和的CD133+細胞和被飽和的CD133+細胞的結合能力，實驗發(fā)現ADC與未飽和CD133+細胞結合后細胞表面熒光強度較高，而經過AC133飽和后的CD133+細胞表面幾乎檢測不到熒光，表明ADC對CD133+細胞具有良好的靶向結合能力；以流式細胞術檢測經過ADC和DOX處理后的C

8、T-26細胞群體中CD133+細胞的比例，結果表明經過ADC處理后CT-26細胞中CD133+比例降低約0.7％，而經DOX處理后的CT-26細胞群體中CD133+比例并無顯著變化，進一步說明ADC靶向性殺傷CD133+細胞；Western blotting結果顯示ADC處理能上調胞內Jak信號通路蛋白p-STAT3的表達；
　?、劾眯∈蠼Y腸癌細胞構建SCID小鼠皮下移植瘤模型，小鼠腫瘤成瘤率約為90%。采用尾部靜脈注射給藥，通

9、過小鼠腫瘤體積變化，體重變化，藥物抑瘤率以及生存實驗評價不同劑量的ADC、L1-MMAF和DOX的體內活性。實驗結果表明，當ADC劑量為4mg/kg時模型小鼠體重穩(wěn)定，腫瘤生長受抑制程度最大，最高僅為200mm3左右，給藥結束后腫瘤不斷變小直至幾乎消失（<80d），其次為2mg/kg的ADC組和DOX（8mg/kg）組，腫瘤生長均受到不同程度的抑制，且很大程度上延長了小鼠的生存時間，與4mg/kg ADC組相比差異顯著（p<0.05）。