1、目的：
　　以microRNA-150（miR-150）為活性藥物成分（API），以組氨酸-賴氨酸聚合物（Histidine-Lysine Polymer，HKP）作為體內(nèi)導(dǎo)入載體，研究與開(kāi)發(fā)微核酸-多肽注射藥物用于大腸癌的特異性靶向治療。
　　方法：
　　（1）配體靶向型載體與微核酸混合試劑的制備
　　采用1％的瓊脂糖作為凝膠電泳支持物，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，定性觀察不同質(zhì)量的HKP對(duì)micro RNA的包載能力

2、，初步確定HKP與micro RNA的質(zhì)量比。通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射原理，利用激光粒度儀測(cè)量不同質(zhì)量比例的HKP與micro RNA形成納米復(fù)合物的粒徑電位，將其作為HKP與micro RNA不同質(zhì)量比的穩(wěn)定性參考。應(yīng)用一種超靈敏的核酸熒光染料RiboGreen定量試劑對(duì)HKP與micro RNA形成納米復(fù)合物的包封率進(jìn)行測(cè)定。使用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR法對(duì)導(dǎo)入混合制劑后的 LoVo細(xì)胞內(nèi)靶基因mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行半定量分析，以檢測(cè)HKP-mi

3、R-150混合制劑的體外生物學(xué)活性。
　　（2）人大腸癌LoVo細(xì)胞系異體移植瘤模型建立及HKP-miR-150混合制劑藥效學(xué)驗(yàn)證
　　4周齡BALB/c裸鼠在無(wú)特殊病原菌（Specific pathogens free，SPF）環(huán)境下經(jīng)1周的環(huán)境適應(yīng)期后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人大腸癌細(xì)胞系LoVo細(xì)胞用于皮下移植，每只裸鼠皮下接種5×106個(gè)細(xì)胞，約7天后成瘤并將裸鼠隨機(jī)分成6組。將經(jīng)HKP包載的miR-150及其它控制組的微核

4、酸藥物制劑注射入腫瘤組織，每?jī)商熳⑸湟淮嗡幬?，連續(xù)治療9次，整個(gè)過(guò)程共計(jì)18天。隨時(shí)觀察并記錄裸鼠皮下移植瘤大小、形狀及生長(zhǎng)狀況。處死裸鼠后分離皮下腫瘤組織，使用熒光定量 PCR檢測(cè)腫瘤組織標(biāo)本中miR-150的表達(dá)，增殖細(xì)胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA）法檢測(cè)癌細(xì)胞增殖情況及原位TUNEL法檢測(cè)癌細(xì)胞凋亡情況。
　?。?）HKP-miR-150在體內(nèi)代謝分布規(guī)律及HKP安

5、全性評(píng)價(jià)研究
　　通過(guò)cy-3熒光染料對(duì)經(jīng)HKP包載的miR-150及未經(jīng)HKP包載的miR-150進(jìn)行定性對(duì)比分析，觀察 HKP-miR-150混合制劑的在動(dòng)物體內(nèi)代謝以及分布情況。通過(guò)在小鼠和食蟹猴兩個(gè)動(dòng)物種屬分別進(jìn)行急毒和長(zhǎng)毒試驗(yàn)，對(duì)豚鼠進(jìn)行皮膚過(guò)敏試驗(yàn)，評(píng)價(jià)HPK試劑的安全性。
　　結(jié)果：
　　（1）瓊脂糖凝膠電泳顯示HKP與miRNA質(zhì)量比為4:1時(shí)，未能檢測(cè)到游離micro RNA，確定HKP（API）與m

6、icro RNA的質(zhì)量比在4:1及以上均可滿足實(shí)驗(yàn)要求。激光粒度儀測(cè)量顯示，不同質(zhì)量比例的HKP與micro RNA形成納米復(fù)合物粒徑電位數(shù)據(jù)均較穩(wěn)定。核酸熒光染料RiboGreen定量試劑對(duì)HKP與micro RNA形成納米復(fù)合物的包封率測(cè)定結(jié)果顯示：隨著 HKP量的增加，游離 miRNA量在降低，即包封效果在遞增并且4:1的時(shí)候，游離miRNA量非常低，適合用于實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步展開(kāi)。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)HKP-miRNA納米復(fù)合

7、物在體外對(duì)細(xì)胞靶基因的表達(dá)水平，結(jié)果顯示HKP與miRNA質(zhì)量比4:1合適且有效，可以確定作為制劑配方比例。
　?。?）實(shí)驗(yàn)成功建立了裸鼠皮下移植瘤動(dòng)物模型（36/36）。18天給藥結(jié)束后，發(fā)現(xiàn)除了 miRNA-150治療組，其它各組都呈現(xiàn)和未治療控制組相似的生長(zhǎng)趨勢(shì)，而miRNA-150治療組的腫瘤生長(zhǎng)顯著減緩。從第七次治療開(kāi)始，腫瘤生長(zhǎng)明顯被抑制；定量RT-PCR檢測(cè)腫瘤組織中靶向微核酸表達(dá)水平，結(jié)果顯示HKP-miR-150

8、治療組靶向微核酸表達(dá)顯著高于其它組別；檢測(cè)經(jīng)過(guò)治療的腫瘤組織，發(fā)現(xiàn)增殖細(xì)胞核抗原在 HKP-miR-150 mimics治療組中，與其它對(duì)照組和未治療有顯著差別，經(jīng)過(guò)HKP-miR-150 mimics藥物治療的腫瘤組織中的PCNA細(xì)胞核大量減少，提示腫瘤細(xì)胞死亡；使用經(jīng)典細(xì)胞程序化死亡檢測(cè)的 TUNEL法，檢測(cè)經(jīng)過(guò)治療的腫瘤組織，HKP-miR-150 mimics治療組與其它對(duì)照組和未治療組有顯著差別，經(jīng)過(guò)HKP-miR-150 m

9、imics藥物治療的腫瘤組織中的TUNEL細(xì)胞核大量增加，提示治療誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞程序化死亡。
　?。?）cy-3熒光定性分析結(jié)果顯示：經(jīng)HKP包載后，miR-150在動(dòng)物體內(nèi)作用時(shí)間較未經(jīng)HKP包載的miR-150在動(dòng)物體內(nèi)作用時(shí)間顯著延長(zhǎng)。腹腔臟器成像結(jié)果顯示：HKP-miR-150-Cy-3組小鼠小腸、結(jié)直腸、腎臟、脾臟在24h后仍有藥物富集。安全性評(píng)價(jià)結(jié)果顯示應(yīng)用HKP包載體的動(dòng)物均未見(jiàn)明顯全身急性毒性和長(zhǎng)期反應(yīng)以及皮膚過(guò)敏反

10、應(yīng)，HKP載體安全劑量大于1080μg/kg。
　　結(jié)論：
　　HKP與miRNA按照4:1質(zhì)量比進(jìn)行混合后，游離miRNA顯著減少，可與HKP形成穩(wěn)定的復(fù)合物，同時(shí)顯著提高了miRNA在體內(nèi)的穩(wěn)定性。動(dòng)物藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示該混合制劑通過(guò)瘤內(nèi)注射可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞程序化凋亡，有效抑制腫瘤細(xì)胞增長(zhǎng)。安全性評(píng)價(jià)研究結(jié)果顯示HKP作為多肽聚合物，具有無(wú)毒、生物可降解性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，因此，HKP可以作為一種高效低毒的miRNA藥物載體，應(yīng)用于m