1、腸病毒(EV)為小RNA病毒科中最主要的病毒屬，以腸病毒71(EV71)和柯薩奇病毒A16(CA16)為主的包括CA6、CA10、CA5和CB3在內(nèi)的多個(gè)型別腸病毒感染所引起的手足口病(HFMD)成為腸病毒感染最嚴(yán)重的疾病。目前，對于HFMD尚無特異有效的治療藥物和疫苗。
　　宿主的體液免疫在防御病毒感染中起到舉足輕重的作用。在宿主應(yīng)對EV71和CA16等腸病毒感染的體液免疫反應(yīng)方面，腸病毒感染后宿主不僅產(chǎn)生中和抗體，也產(chǎn)生非中和

2、抗體，這種非中和抗體反應(yīng)如何產(chǎn)生，對中和抗體反應(yīng)是否有影響，是否普遍存在于宿主的腸病毒感染過程中？本研究將對這些問題進(jìn)行研究。主要內(nèi)容如下：
　　一、人體抗-EV71衣殼蛋白非中和抗體反應(yīng)特點(diǎn)的研究
　　在全基因合成獲得的EV71衣殼蛋白VP1、VP0和VP3的pMD-18T質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，通過PCR方法獲得EV71 VP0、VP3、VP1和VP1截短體抗原(VP11-60(1-60aa)、VP145-58(45-58aa)、

3、VP141-297(41-297aa)、VP161-297(61-297aa)和VP1134-297(134-297aa))的DNA序列，構(gòu)建原核表達(dá)載體，表達(dá)并純化獲得重組目的蛋白。以本室自主研發(fā)的新型免疫球蛋白結(jié)合分子（NEIBM）LD5作為酶標(biāo)二抗，建立抗-EV71衣殼蛋白抗體檢測的NEIBM-ELISA方法。收集江蘇省無錫市33份HFMD重癥患者血清標(biāo)本、194份非手足口病兒童門診血清標(biāo)本和200份上海市正常獻(xiàn)血員血清標(biāo)本。應(yīng)用

4、NEIBM-ELISA方法分析33份HFMD重癥患者和200份正常成人血清抗-EV71衣殼蛋白VP1、VP0和VP3的非中和抗體反應(yīng)。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HFMD重癥病例和正常成人血清中均存在高水平的抗-EV71三種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1+VP0+VP3)抗體反應(yīng)。說明人群普遍存在高水平的抗-EV71衣殼蛋白抗體反應(yīng)，且以抗-VP1反應(yīng)性最強(qiáng)，為優(yōu)勢抗體反應(yīng);進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)抗-EV71 VP1的抗體反應(yīng)主要針對基于CECRS的各類表位，這些表位

5、主要可分為3類:核心抗原(VP145-58)、N抗原(VP11-60)和C抗原(VP141-297)。
　　二、上海兒童抗-腸病毒VP1非中和抗體反應(yīng)特點(diǎn)的研究
　　應(yīng)用重疊延伸PCR方法體外合成和逆轉(zhuǎn)錄PCR法獲得來自EVA（種）的EV71和CA16、EV-B的CB3、EV-C的PV1和RV-A的RV13 VP1的基因序列，構(gòu)建pET-21b-EV71 VP1、pET-21b-CA16 VP1、pET-21b-CB3 VP

6、1、pET-21 b-PV1VP1和pET-21b-RV13 VP1的原核表達(dá)載體，表達(dá)并純化重組目的蛋白。應(yīng)用NEIBM-ELISA和競爭ELISA檢測364份上海市非HFMD兒童門診血清標(biāo)本(8個(gè)年齡段:＜28d、1-6m、6m-12m、12m-24m、24m-36m、36m-48m、48m-60m和60m-72m)抗-5個(gè)腸病毒VP1非中和抗體反應(yīng)水平;篩選獲得各腸病毒抗-VP1高反應(yīng)血清抗體，競爭ELISA進(jìn)一步檢測不同腸病毒抗

7、-VP1非中和抗體反應(yīng)，并將抗體反應(yīng)性及競爭抑制反應(yīng)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)差異和相關(guān)性分析。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)，＜28d的新生兒腸病毒的非中和抗體代表母體轉(zhuǎn)運(yùn)的IgG水平，1-12m主要反應(yīng)母體非中和抗體水平消退至最低點(diǎn)并開始進(jìn)入原發(fā)感染期，12-72m主要反應(yīng)腸病毒原發(fā)感染期的狀況。母體IgG(＜28d)與原發(fā)感染期(12-72m)腸病毒的非中和抗體水平和競爭抑制水平均顯示明顯的層級:經(jīng)呼吸道傳播的腸病毒RV-A(RV13)非中和抗體反應(yīng)水平

8、高于腸道傳播的腸病毒，腸道傳播的病毒EV-B(CB3)高于EV-C(PV1)高于EVA，EVA內(nèi)CA16明顯高于EV71。抗-各種腸病毒VP1在12-72m和＜28d兩個(gè)年齡段反應(yīng)相關(guān)性與其VP1序列的同源性大致相符，競爭抑制的相關(guān)性則明顯受序列同源性和抗體水平二者的影響。不同腸病毒抗-VP1競爭抑制水平及其相關(guān)系數(shù)在＜28d和12-72m兩個(gè)年齡段的差別反映了成年母體與原發(fā)感染期非中和抗體反應(yīng)的不同。
　　三、不同的抗-CA16

9、 VP1非中和抗體反應(yīng)的發(fā)現(xiàn):特異性或非特異性的抗體反應(yīng)
　　在全基因合成的CA16VP1-pMD-18T質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，通過PCR方法獲得CA16VP1全長及截短體抗原(pET-21b-CA16 VP1、pET-32a-VP146297、pET-32a-VP161-297、pET-32a-VP11-60、pET-32a-VP145-58)的DNA序列，構(gòu)建其原核表達(dá)質(zhì)粒，原核表達(dá)并純化目的蛋白。應(yīng)用NEIBM-ELISA和競爭EL

10、ISA的方法分析上海獻(xiàn)血員和山西老年人兩種人群血清抗-CA16 VP1非中和抗體反應(yīng)水平，應(yīng)用CA16 VP1全長及截短體抗原對上述高反應(yīng)血清進(jìn)行NEIBM-ELISA檢測，并用不同CA16 VP1截短體與全長VP1競爭結(jié)合兩種人群高反應(yīng)血清抗-CA16 VP1抗體，并將抗體反應(yīng)性及競爭抑制反應(yīng)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)差異和相關(guān)性分析;同時(shí)測定兩種人群不同競爭抑制類型抗-CA16中和抗體效價(jià)。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上海獻(xiàn)血員抗-CA16 VP1非中

11、和抗體反應(yīng)與EV71相似，也主要針對基于CECRS的抗原。兩種人群存在不同的抗-CA16 VP1的抗體反應(yīng)和競爭抑制模式，上海獻(xiàn)血員CA16 VP1各抗原反應(yīng)相關(guān)性明顯高于山西老年人，且各抗原抑制相關(guān)性也普遍明顯高于山西老年人，顯示抗-CA16 VP1抗體反應(yīng)的一致性，提示上海獻(xiàn)血員存在特異的抗-CA16抗體反應(yīng)。上海獻(xiàn)血員抗-CA16 VP1抗體反應(yīng)出現(xiàn)優(yōu)勢競爭抑制類型，其中和抗體效價(jià)明顯高于其他類型，符合特異抗體反應(yīng)特性，為特異的C

12、A16病毒感染所引起，山西老年人則顯示出是由其它腸病毒感染引起的的非特異抗-CA16抗體反應(yīng)特點(diǎn)。另外，抗-CA16VP141-297與抗-CA16VP11-297等反應(yīng)相關(guān)系數(shù)和的競爭抑制相關(guān)系數(shù)的差異可用來提示不同人群CA16特異感染的流行水平。
　　四、非中和抗體反應(yīng)在小鼠上的誘導(dǎo)及其對中和抗體反應(yīng)影響的研究
　　原核表達(dá)和純化pET21 b-EV71、pET21 b-CA16、pET21b-CA5、pET21 b-C

13、A6、pET21b-CA10、pET21b-CB3、pET21b-PV1和pET21b-RV13等腸病毒的VP1抗原;設(shè)計(jì)各種方案，應(yīng)用不同腸病毒VP1（除EV71VP1或CA16VP1外）交叉接種小鼠（交叉組），構(gòu)建腸病毒交叉免疫模型以模擬人群非中和抗體反應(yīng)情況，同時(shí)設(shè)置EV71 VP1（EV71組）或CA16VP1（CA16組）接種組和陰性對照組，收集各免疫階段的血清標(biāo)本;表達(dá)純化EV71和CA16VP1的核心抗原、N抗原、C抗原、

14、非CECRS抗原及全長VP1抗原，對上述血清標(biāo)本進(jìn)行ELISA和競爭ELISA分析，測定針對EV71 VP1和CA16VP1各抗原抗體的動(dòng)態(tài)變化情況，探討以交叉反應(yīng)為特征的腸病毒非中和抗體反應(yīng)可能的形成機(jī)制及變化特點(diǎn)，探討非中和抗體對誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的影響。
　　通過不同腸病毒VP1蛋白免疫構(gòu)建小鼠腸病毒交叉免疫模型，發(fā)現(xiàn)隨著不同VP1交叉接種次數(shù)的增加，EV71交叉組抗-EV71 VP11-60反應(yīng)性逐漸趕上并超過VP161-2

15、97，VP141-297反應(yīng)性逐漸趕上VP11-297，EV71 VP1抗體反應(yīng)向CECRS表位偏移。EV71組，抗-EV71抗體反應(yīng)性與VP1抗原長度成比例，未出現(xiàn)向CECRS表位偏移。競爭ELISA也顯示EV71交叉組包含CECRS的EV71 VP1抗原能較好的抑制抗-EV71 VP1非中和抗體反應(yīng)。不同VP1分別對EV71交叉組和EV71組小鼠抗-EV71 VP1和抗-CA16 VP1的4種競爭抑制模式顯示出各自的特點(diǎn)，在上海市＜

16、28d兒童各種腸病毒VP1的競爭抑制反應(yīng)中出現(xiàn)了分別與4種競爭抑制模式相對應(yīng)的情況。上述結(jié)果提示，腸病毒VP1蛋白交叉免疫小鼠可成功誘導(dǎo)出與人群中相似的非中和抗體反應(yīng)，提示某種腸病毒感染誘導(dǎo)的抗-VP1反應(yīng)可形成對其他腸病毒VP1的交叉反應(yīng)，多種腸病毒的感染可導(dǎo)致非中和抗體反應(yīng)向CECRS表位偏移。
　　總結(jié):
　　本研究我們首次發(fā)現(xiàn)了主要針對CECRS表位的抗-EV71 VP1抗體反應(yīng)，提出人腸病毒非中和抗體反應(yīng)的概念。檢

17、測發(fā)現(xiàn)正常成人、老年人、手足口病患兒和不同年齡段兒童等各類人群中普遍存在各腸病毒抗-VP1非中和抗體反應(yīng)。首次在嬰幼兒中系統(tǒng)、全面地觀察到從出生到6歲時(shí)與中和抗體相似的各腸病毒抗-VP1非中和抗體反應(yīng)的動(dòng)態(tài)變化過程，提出了母體轉(zhuǎn)移IgG抗體反應(yīng)和原發(fā)感染抗體反應(yīng)概念。在小鼠模型上可成功誘導(dǎo)出與人群中的非中和抗體反應(yīng)相似的抗-EV71 VP1/CA16的非中和抗體反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)了多種腸病毒感染導(dǎo)致非中和抗體反應(yīng)向CECRS表位偏移的人腸病毒非