1、目的:
　　糖尿病發(fā)病機制中有兩個重要環(huán)節(jié)，就是胰島β細胞分泌胰島素不足和周圍組織的胰島素抵抗。如何促進胰島β細胞的增殖、誘導β細胞再生并抑制β細胞凋亡是近年研究的熱點。胰島ε細胞與β細胞來源于共同的內分泌前體細胞，通過內源性機制保持分化的平衡。Ghrelin表達于ε細胞，insulin表達于β細胞。前期研究已發(fā)現宮內營養(yǎng)不良新生大鼠胰島存在ε/β細胞分化失衡，其ε細胞數量和分布也與對照組顯著不同，且上述ε/β細胞失衡與后期糖尿病

2、風險密切相關。因此，明確ε/β分化失衡的機制有助于調控β細胞定向分化和增殖，是從發(fā)育早期干預和逆轉糖尿病進程的重要切入點。新近的研究發(fā)現，自噬在調控ε/β分化、防止β細胞凋亡、維持β細胞數量及內環(huán)境穩(wěn)定方面發(fā)揮極其重要的作用。
　　自噬(autophagy)是細胞內形成的雙層膜結構的自噬小體，包裹所降解的物質、大分子或細胞器，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內容物，以實現細胞本身的代謝需要和某些細胞器的更新。自噬相關蛋

3、白7(autophagy-related protein7，Atg7)是維持成年干細胞多向分化性的重要調節(jié)因子;雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是細胞內營養(yǎng)狀態(tài)的感受器，當細胞內營養(yǎng)豐富時，mTOR活化，通過抑制下游Atg蛋白，抑制自噬的發(fā)生;饑餓狀態(tài)時mTOR活化被抑制，Atg家族成員活化，促進自噬體的形成。mTOR抑制因子及自噬活化因子能夠顯著提高誘導性多能干細胞產生的速度和效率

4、;自噬也有助于維持處于分化終點的細胞穩(wěn)態(tài)。
　　基于以上背景，自噬可能在胰島β細胞和ε細胞分化過程中發(fā)生作用，但具體機制尚不清楚。本研究擬用小鼠胰島細胞瘤MIN6細胞株為模型，在體外培養(yǎng)，通過抑制或誘導劑調控自噬信號，在培養(yǎng)的不同階段加入針對不同自噬階段抑制劑或誘導劑，觀察其對MIN6細胞株表達定向ghrelin分布和insulin的變化，以此推測其分化為ε/β細胞的潛能的變化，希望本結果可以為探索1型糖尿病的發(fā)生原因奠定基礎。<

5、br>　　方法:
　　利用小鼠胰島素瘤MIN6細胞株，在培養(yǎng)的不同階段加入針對不同自噬階段的抑制劑或誘導劑，以PT-PCR、Western blot檢測其對培養(yǎng)細胞自噬途徑中關鍵因子LC3、Atg7、LAMP2、p62等表達的影響，同時以免疫熒光檢測MIN6細胞株表達ghrelin分布和insulin的變化，來探討自噬對胰島ε/β細胞分化的影響。
　　結果:
　　1.誘導/抑制自噬過程中幾種自噬調控蛋白與效應蛋白的mR

6、NA水平及蛋白水平進行檢測發(fā)現，饑餓組細胞BECLIN1表達降低(P＜0.05)，Atg7、LAMP-2基因表達增高，Lc3和P62基因未見明顯改變;3-MA組細胞中BECLIN基因和Lc3基因表達降低(P＜0.05)，其余基因未見明顯的改變。Western-blotting對比檢測抑制/誘導組與正常對照組中LC3與p62、LAMP2的水平，相對于對照組細胞，饑餓組細胞P62蛋白水平堆積(P＜0.05)，Lc3-Ⅱ/Ⅰ表達降低(P＜0.

7、05);3-MA組細胞中P62水平未見明顯變化，Lc3-Ⅱ/Ⅰ比例明顯降低(P＜0.05)。LAMP-2蛋白在三組細胞中的表達未見明顯變化。
　　2.RT-PCR的結果同免疫熒光結果相一致，饑餓組細胞insulin基因的轉錄水平明顯升高，3-MA組細胞insulin基因的轉錄水平則明顯降低，饑餓組和3-MA組ghrelin基因的轉錄水平都顯著降低。
　　3.細胞分化實驗的免疫熒光結果顯示，同對照組細胞相比，饑餓組細胞分泌in