1、在非興奮性細胞，細胞外鈣離子最主要通過鈣池操縱的鈣通道(store-operatedCa2+channels，SOCs)進入細胞內(nèi)，從而參與多種細胞生命活動的調(diào)節(jié)，如細胞的增殖和凋亡，因為SOCs通道在非興奮性細胞生理作用上的特殊性和重要性，近年來越來越受到研究關(guān)注。間質(zhì)相互作用因子1(stromal interaction molecule1，STIM1)是細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上表達的蛋白，近年來經(jīng)大量的研究證明它與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)識別細胞內(nèi)鈣濃度有關(guān)

2、，鈣釋放激活鈣通道蛋白1(Calcium release-activated calciumchannel proteinl，Orai1)是細胞膜上眾多的鈣離子通道之一，STIM1與Orai1現(xiàn)在已經(jīng)被認定為SOCs的兩個重要組成部分。
　　重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是常見急腹癥，胰腺炎的胰外器官損害很常見，其中又以急性肺損傷(acute lung injury of rats，A

3、LI)發(fā)生最為常見。近年來大量研究都證實肺微血管內(nèi)皮細胞損傷在急性肺損傷發(fā)病的過程中起關(guān)鍵作用。
　　目的:
　　研究大鼠重癥急性胰腺炎肺損傷過程中(store-operated calcium entry，SOCE)相關(guān)蛋白的變化及抑制SOCE的影響和LPS刺激肺微血管內(nèi)皮細胞后SOCE相關(guān)蛋白變化及RNA干擾后的影響，探討SOCE相關(guān)蛋白在重癥急性胰腺炎肺損傷發(fā)病機制中的作用，為臨床治療和預(yù)防重癥急性胰腺炎肺損傷找到新的

4、靶點。
　　方法:
　　實驗一:健康雄性(Spraghe-Dawley, SD)大鼠30只，體重約200g，隨機分為3組:假手術(shù)組(CON)，2-APB治療組(2-APB+SAP)和SAP模型組(SAP)。SAP動物模型采用1.5％的去氧膽酸鈉溶液(1ml/kg)逆行胰膽管注射法。2-APB治療組造模前24小時按腹腔注射2-APB(2.5mg/kg)。假手術(shù)組僅開腹輕翻胰腺后即關(guān)腹。造模24h后，各組大鼠麻醉后開腹，腹主動脈

5、采血并取胰腺、肺組織。
　　觀察胰腺和肺組織的大體病理改變，HE染色法觀察肺組織及胰腺組織的病理改變，行胰腺和肺組織病理評分;取左肺組織，測定其干濕質(zhì)量，計算肺組織含水量;用全自動血氣檢測儀進行動脈血氣分析測定，計算氧合指數(shù)(PaO2/FiO2);采用碘-淀粉比色法并對血淀粉酶的含量進行測定;使用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測血清TNF-α和IL-6水平;采用Real-time PCR測定肺組織中Orai1、STIM1 mR

6、NA的水平;采用蛋白印跡(Western blot)法檢測Orai1、STIM1蛋白在肺組織中的表達。
　　實驗二:實驗動物、分組及造模方法同實驗一。造模24h后，各組大鼠麻醉下開腹，取肺組織。
　　采用免疫熒光法檢測肺微血管上皮細胞Orai1、STIM1蛋白的表達;采用末端脫氧核甘酸轉(zhuǎn)移酶介導dUTP缺口末端標記方法(terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated dUTP-bi

7、otin nick-end labeling，TUNEL)檢測大鼠肺微血管上皮細胞凋亡的情況;應(yīng)用透射電鏡觀察大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)變化;采用Real-time PCR檢測肺組織中Bax、caspase3mRNA的水平。
　　實驗三:由Pricells公司購進的大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞系，經(jīng)復蘇、培養(yǎng)、傳代，于第五代開始用于實驗。根據(jù)在Genebank中檢索的大鼠STIM1、Orai1基因序列，設(shè)計、合成3對針對大鼠STIM1、

8、Orai1基因的小干擾RNA序列，應(yīng)用陽離子脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞。
　　培養(yǎng)大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞，應(yīng)用Negative control FAM小干擾RNA序列轉(zhuǎn)染大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞，48h后應(yīng)用免疫熒光法檢測小干擾RNA序列轉(zhuǎn)染效率;
　　培養(yǎng)大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞共分8組;Mock組（只加陽離子脂質(zhì)體2000，不加小干擾RNA序列）; Negative control干擾組;STIM1干擾組1;STIM1

9、干擾組2;STIM1干擾組3;Orai1干擾組1;Orai1干擾組2;Orai1干擾組3。轉(zhuǎn)染48h，應(yīng)用Real-time PCR方法驗證其對STIM1、Orai1表達抑制的有效性，挑選抑制效應(yīng)最強的小干擾RNA序列進行下一步實驗。
　　培養(yǎng)大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞分為5組:空白對照組(B lank)，培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)72h; LPS刺激組，培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)48h，加入LPS(100ng/ml)繼續(xù)刺激24h;STIM1干擾組:使用陽離

10、子脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染相應(yīng)的siRNA，轉(zhuǎn)染48h后，加入LPS(100ng/ml)繼續(xù)刺激24h; Orai1干擾組:使用陽離子脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染相應(yīng)的siRNA，轉(zhuǎn)染48h后，加入LPS(100ng/ml)繼續(xù)刺激24h; NFATc3抑制劑組，培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)48h，加入LPS(100ng/ml)和INCA-6(1.0uM)繼續(xù)刺激24h。
　　各組細胞用藥物作用24 h后，以MTT檢測法檢測細胞存活率;以TUNEL檢測法檢測細

11、胞凋亡比率;以Western blot檢測法檢測細胞STIM1、Orai1蛋白表達水平;以Realtime-PCR法檢測肺微血管內(nèi)皮細胞中STIM1、Orai1、NFATc3、Bax和caspase3 mRNA的水平變化。
　　結(jié)果:
　　實驗一:與CON組相比，SAP組胰、肺組織病理損傷明顯，病理評分增高;肺組織含水量升高，氧合指數(shù)降低;血清淀粉酶、TNF-α和IL-6含量升高;肺組織中STIM1和Orai1 mRNA和蛋

12、白表達水平明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　與SAP組相比，2-APB治療組的胰、肺病理損傷較輕，病理評分降低;肺組織含水量降低，氧合指數(shù)升高;血清淀粉酶、TNF-α和IL-6含量降低;肺組織中STIM1和Orai1 mRNA和蛋白表達水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　實驗二:
　　與CON組相比，SAP組肺微血管上皮細胞Orai1、STIM1蛋白的表達明顯升高;肺微血管內(nèi)皮細胞凋亡比率

13、增加;肺組織中Bax、caspase3 mRNA的水平明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);肺微血管內(nèi)皮超微結(jié)構(gòu)損傷明顯。
　　與SAP組相比，2-APB治療組的肺微血管上皮細胞Orai1、STIM1蛋白的表達明顯降低;肺微血管內(nèi)皮細胞凋亡比率降低;肺組織中Bax、caspase3 mRNA的水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);肺微血管內(nèi)皮超微結(jié)構(gòu)損傷減輕。
　　實驗三:
　　免疫熒光檢測小干擾RNA序列

14、轉(zhuǎn)染效率約80％;篩選出針對大鼠STIM1、Orai1的小干擾RNA序列各一條，Real-time PCR驗證可有效抑制STIM1、Orai1mRNA轉(zhuǎn)錄水平，抑制效率在70％以上。
　　與Blank組比較，LPS組肺微血管內(nèi)皮細胞細胞存活率降低、凋亡比率升高;細胞中STIM1、Orai1轉(zhuǎn)錄及表達水平升高，NFATc3、Bax和caspase3 mRNA的水平增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　與LPS組比較，L

15、PS+STIM1干擾組，LPS+Orai1干擾組，LPS+INCA-6組肺微血管內(nèi)皮細胞細胞存活率升高、凋亡比率降低;細胞中NFATc3、Bax和caspase3 mRNA的水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.采用膽胰管逆行注射去氧膽酸鈉制備SD大鼠急性胰腺炎肺損傷的模型，可以成功的模擬重癥急性胰腺炎并發(fā)急性肺損傷的癥狀。
　　2.大鼠重癥急性胰腺炎肺損傷過程中，肺組織STIM1、Orai

16、1轉(zhuǎn)錄及表達水平升高，應(yīng)用SOCE抑制劑2-APB后，STIM1、Orai1轉(zhuǎn)錄及表達水平下調(diào)且肺損傷指標緩解，提示SOCE在急性胰腺炎肺損傷中發(fā)揮重要作用。
　　3.SOCE參與急性胰腺炎肺損傷可能與調(diào)控肺微血管內(nèi)皮細胞凋亡有關(guān)。
　　4.SOC抑制劑的急性胰腺炎肺損傷的保護作用可能是通過抑制線粒體介導凋亡相關(guān)。
　　5.LPS刺激可增高STIM1、Orai1表達，從而加重肺微血管內(nèi)皮細胞損傷。
　　6.針對S