1、目的:通過微生物遺傳學、生物化學與分子生物學等分析手段系統(tǒng)的研究，較為全面的闡述Escherichia coli IscA及其同源蛋白SufA在鐵硫簇組裝中的生理功能，以及銅離子結合IscA蛋白質介導的鐵硫簇組裝障礙而殺菌的具體機制，從而為鐵硫簇組裝機制和銅的殺菌機制研究奠定了重要的理論基礎。
　　方法:
　　1.Escherichia coli IscA/SufA蛋白在不同類型鐵硫簇合成中的功能研究
　　2.銅離子結

2、合E.coli IscA蛋白介導的殺菌機制研究
　　結果:
　　1.E.coli IscA/SufA蛋白在不同類型鐵硫簇合成中的功能研究
　　1.1.添加支鏈氨基酸和硫胺素能部分恢復E.coli iscA/sufA雙突變菌在M9基礎培養(yǎng)基中的生長在有氧生長條件下，E.coli iscA/sufA雙突變菌在M9基礎培養(yǎng)基中產(chǎn)生不能生長的表型，在M9基礎培養(yǎng)基中添加1.0μg/mL的硫胺素不能恢復E.coli iscA/s

3、ufA雙突變菌的生長，但添加90μg/mL的三種支鏈氨基酸能少量恢復E.coli iscA/sufA雙突變菌的生長，同時添加硫胺素和支鏈氨基酸入M9基礎培養(yǎng)基中，能夠進一步增加E.coli iscA/sufA雙突變菌的生長。
　　1.2.有氧生長條件下，iscA/sufA雙突變菌內(nèi)IlvD蛋白不能組裝[4Fe-4S]鐵硫簇在有氧條件下，支鏈氨基酸合成途徑中IlvD，表達于fscA/sufA雙突變菌中與表達于野生型、iscA和suf

4、A單突變菌相比，幾乎沒有活性，而蛋白表達量沒有明顯影響。純化于野生型E.coli中的IlvD蛋白在415 nm具有一個典型的[4Fe-4S]鐵硫簇且有完全的活性，而純化于E.coli iscA/sufA雙突變菌中的IlvD蛋白消失了415nm處吸收峰且沒有活性，IlvD蛋白鐵和硫含量測定顯示純化于野生型E.coli中的每摩爾IlvD蛋白含有1.6±0.4摩爾鐵和1.4±0.3摩爾無機硫，表明大約40％純化的IlvD蛋白含有完整的[4Fe

5、-4S]鐵硫簇。相反，純化于E.coli iscA/sufA雙突變菌中的IlvD蛋白測不到鐵和硫的含量。
　　1.3.IscA-Fe/SufA-Fe能提供鐵給二羥酸脫水酶IlvD進行[4Fe-4S]鐵硫簇的體外組裝 IscA-Fe與apo-IlvD、半胱氨酸脫硫酶IscS、L-半胱氨酸(L-cysteine)和二硫蘇糖醇在37℃有氧條件下孵育，IlvD活性很快得到恢復，而對照樣品apo-IscA，在孵育后IlvD活性沒有恢復。Il

6、vD經(jīng)離子交換層析柱MonoQ再次純化后蛋白在415 nm處出現(xiàn)特異的IlvD鐵硫簇吸收峰，表明IlvD經(jīng)過體外重組后[4Fe-4S]鐵硫簇已經(jīng)組裝到蛋白質上;利用SufA-Fe作為鐵的供體，我們獲得了類似的結果。
　　1.4.IscA/SufA蛋白參與了其它鐵硫酶中[4Fe-4S]鐵硫簇組裝在野生型E.coli和iscA/sufA雙突變菌中重組表達硫胺素生物合成途徑中的ThiC、三羧酸循環(huán)中途徑中的aconitase B和DNA

7、堿基切除修復途徑中核酸內(nèi)切酶Ⅲ，SDS-PAGE電泳分析結果顯示IscA/SufA的缺失沒有明顯的影響蛋白質的表達和接下來的純化，蛋白質全波長掃描結果顯示純化于野生型E.coli中的ThiC、aconitaseB和核酸內(nèi)切酶Ⅲ分別在410、413和419nm處出現(xiàn)[4Fe-4S]結合的吸收峰，并且蛋白質都測到一定濃度的鐵和硫，而純化于iscA/sufA雙突變菌中的ThiC、aconitaseB和核酸內(nèi)切酶Ⅲ沒有出現(xiàn)相應鐵硫簇的吸收峰也測

8、不到鐵和硫的含量。
　　2.銅離子結合E.coli IscA蛋白介導的殺菌機制研究
　　2.1.在ISC鐵硫簇組裝系統(tǒng)中IscA蛋白具有獨特的且很強的銅離子結合能力在LB培養(yǎng)基中添加200μM CuSO4對表達于copA/cueO/cusA三突變菌中IscS、IscU、HscB、HscA和Ferredoxin的全波長掃描光譜幾乎沒有影響，唯獨IscA蛋白在258 nm處出現(xiàn)了1個蛋白質半胱氨酸殘基與Cu(Ⅰ)結合的特異吸收峰

9、，蛋白中銅元素含量結果顯示每分子IscA蛋白二聚體含有0.60±0.09分子銅原子，而在IscS，HscB和HscA蛋白中只有非常微量或未檢測到銅元素，IscU和ferredoxin蛋白保留有少量，并且可重復實驗數(shù)量的銅元素，但蛋白中銅元素在后續(xù)純化步驟中會進一步減少，說明銅離子與IscU和ferredoxin蛋白的結合力較弱;在添加200μM CuSO4 LB培養(yǎng)基中生長的copA/cueO/cusA三突變菌中表達并純化獲得的IscA

10、蛋白，無EPR信號，而當使用2.5％(v/v)硝酸處理純化后的IscA蛋白，使其結合的Cu(Ⅰ)被氧化，出現(xiàn)了一個典型的以Cu(Ⅱ)為中心的EPR信號，定量Cu(Ⅱ)的EPR信號表明純化后的IscA蛋白含有0.55±0.12銅原子/IscA二聚體，與采用新亞銅試劑測定的結果基本一致;在LB培養(yǎng)基中誘導copA/cueO/cusA三突變菌中重組IscA蛋白的表達，并且與不同濃度的銅離子孵育，結果表明，當CuSO4濃度從0增加至1 mM時，

11、與IscA蛋白結合的銅離子逐步從0增加到大約1.4銅原子/IscA二聚體，然而copA/cueO/cusA三突變菌的生長量卻降低了30％，細菌的生長與IscA銅結合相關性分析結果顯示當銅離子濃度從0增加到1mM時，銅離子與IscA蛋白的結合量與copA/cueO/cusA三突變菌的生長量呈負相關關系。
　　2.2.IscA蛋白體外銅離子結合活性 apo-IscA與CuSO4共孵育并將IscA蛋白重新純化，隨著溶液中銅離子濃度的不斷

12、增加，純化獲得的IscA蛋白在258 nm處的吸收峰峰值和銅元素含量逐漸增加，并且當CuSO4濃度為IscA蛋白兩倍以上時，IscA結合的銅離子含量達到飽和值（2.2±0.4銅原子/IscA二聚體），IscA結合的銅離子含量與低濃度銅離子時幾乎是線性關系，再純化的IscA蛋白，采用2.5％（v/v）硝酸處理就會出現(xiàn)了典型的Cu(Ⅱ)結合為中心的EPR信號，隨著溶液中CuSO4濃度的不斷增加，EPR信號強度也逐漸增加;離子交換層析法分析重

13、新純化后獲得的IscA蛋白，銅離子結合IscA蛋白后導致蛋白洗脫峰從第10和11管(apo-IscA)遷移至第13和14管（結合銅離子的IscA蛋白），表明IscA結合銅離子后其蛋白構象可能發(fā)生顯著變化。
　　2.3.IscA中保守的半胱氨酸殘基參與了銅離子的結合當將野生型apo-IscA與鐵/銅離子孵育分別生成鐵結合形式IscA（在315nm處有一吸收峰）或者銅結合形式IscA（在258 nm處有一吸收峰），與此相反，當將突變型

14、IscA與鐵或銅離子孵育后未檢測到對應的吸收峰，蛋白質中鐵和銅含量的測定結果顯示，突變體IscA與鐵/銅孵育并再純化后沒有測到鐵/銅含量，與光譜學分析的結果一致;在添加有鐵/銅離子的LB培養(yǎng)基中，在E.coli copA/cueO/cusA三突變菌中表達野生型IscA及其突變體蛋白，同樣，不像野生型IscA蛋白，IscA突變體蛋白沒有結合任何鐵或銅離子。這些表明IscA蛋白中三個保守半胱氨酸殘基是維持其鐵和銅離子結合活性必需位點。

15、>　　結論:根據(jù)實驗結果可以得出以下結論:(1)IscA/SufA蛋白主要參與了有氧生長條件下E.coli中[4Fe-4S]鐵硫簇的組裝，而不參與[2Fe-2S]鐵硫簇的組裝，所以[4Fe-4S]鐵硫簇和[2Fe-2S]鐵硫簇可能具有完全不一樣的合成途徑;(2)IscA蛋白除了鐵結合能力外，還具有獨特的且很強的銅結合能力，IscA中三個保守的半胱氨酸殘基對蛋白質結合銅和鐵都很重要;(3)過量銅還能夠通過競爭結合IscA中鐵的結合位點，從

16、而影響E.coli中[4Fe-4S]鐵硫簇的組裝，而對[2Fe-2S]鐵硫簇的組裝沒有明顯影響;(4)IscA的缺失或者培養(yǎng)基中加銅都能導致[4Fe-4S]鐵硫簇的組裝障礙，而在IscA缺失情況下加銅不能進一步加重[4Fe-4S]鐵硫簇的組裝缺陷，說明IscA可能是銅的主要毒性靶點;(5)銅對于鐵硫蛋白預先組裝好的[4Fe-4S]鐵硫簇沒有明顯的影響，而對于新合成的蛋白中[4Fe-4S]鐵硫簇組裝影響顯著，說明銅主要是影響了鐵硫簇的合成