1、目的：
　　乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一。近年來，其發(fā)病率及死亡率在我國及全世界呈上升趨勢。盡管放療、化療、分子靶向治療及多種生物治療手段有了長足發(fā)展，但乳腺癌復發(fā)、轉(zhuǎn)移等仍然是導致乳腺癌患者死亡的重要原因。因此，探索乳腺癌浸潤、轉(zhuǎn)移的分子生物學機制成為現(xiàn)今的研究熱點。越來越多證據(jù)表明，TET1（ten-eleven translocation1）是催化DNA去甲基化過程的重要蛋白，可通過促使5-甲基胞嘧啶（5mC）轉(zhuǎn)化為5-羥

2、甲基胞嘧啶（5hmC），參與 DNA去甲基化和相關(guān)基因表達的調(diào)控過程。在人類實體腫瘤中，TET1基因突變與腫瘤發(fā)生發(fā)展有著顯著相關(guān)性，積極探索其與乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的機制，將為治療乳腺癌提供重要的實驗依據(jù)。
　　為此，本研究以人乳腺癌MDA-MB-231細胞株為模型，通過建立過表達TET1的MDA-MB-231細胞株，研究TET1對MDA-MB-231細胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲等生物學行為的影響，并初步探究其相關(guān)分子機制，旨在為臨床預防和治

3、療腫瘤尋找新的靶點。
　　方法：
　　1應(yīng)用慢病毒載體，建立 TET1過表達穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株（ MDA-MB-231-TET1）及攜帶 eGFP的陰性對照組穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株（MDA-MB-231-negative control，MDA-MB-231-NC），SYBR Green法實時熒光定量PCR檢測TET1在轉(zhuǎn)錄水平的表達情況，Western blot法檢測TET1在蛋白水平的表達情況。
　　2倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后的細胞形態(tài)

4、，以 MDA-MB-231-NC作為陰性對照組，以MDA-MB-231作為空白對照組，應(yīng)用CCK-8法檢測過表達 TET1對 MDA-MB-231細胞增殖的影響，應(yīng)用流式細胞學技術(shù)檢測TET1對細胞周期的影響，應(yīng)用細胞劃痕實驗及 TranswellTM小室檢測TET1對細胞遷移、侵襲能力的影響，并應(yīng)用免疫熒光及Western blot檢測TET1與EMT相關(guān)蛋白（E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、β-cate

5、nin）分子的表達。
　　3將MDA-MB-231-TET1、MDA-MB-231-NC及MDA-MB-231三組細胞分別接種于裸鼠腋下，建立人乳腺癌裸鼠移植瘤模型，觀察腫瘤生長情況，比較三組細胞成瘤時間、瘤體體積及質(zhì)量，并繪制生長曲線。
　　4應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，兩獨立樣本的比較應(yīng)用成組 t檢驗分析，多組間均數(shù)比較應(yīng)用單因素方差分析，數(shù)據(jù)用 mean±SD表示，每組實驗不少于3個獨立樣本的重復，以P<

6、0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　1成功建立過表達 TET1的 MDA-MB-231細胞模型，SYBR Green法實時定量PCR檢測TET1表達，結(jié)果顯示，在過表達模型中，與陰性對照組（MDA-MB-231-NC）相比，MDA-MB-231-TET1細胞中TET1上調(diào)3.11±4.61倍，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；Western blot檢測TET1表達，應(yīng)用 Image J掃描灰度值，結(jié)果顯示，與陰

7、性對照組（ MDA-MB-231-NC）相比， MDA-MB-231-TET1細胞中 TET1上調(diào)2.67±1.55倍，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　2 CCK-8法檢測細胞增殖能力，空白對照組（MDA-MB-231）及陰性對照組（MDA-MB-231-NC）之間，細胞增殖未見明顯差異（P>0.05），而 MDA-MB-231-TET1細胞增殖能力較前兩組明顯減低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。
　　3流式細

8、胞學技術(shù)檢測細胞周期結(jié)果顯示，與陰性對照組（MDA-MB-231-NC）相比，MDA-MB-231-TET1細胞G2/M期比例增加（MDA-MB-231-TET113.24±3.64％vs MDA-MB-231-NC4.30±1.36%），過表達TET1誘導細胞周期G2/M期阻滯，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。
　　4細胞劃痕實驗細胞檢測腫瘤細胞遷移能力，與空白對照組（ MDA-MB-231）及陰性對照組（ MDA-MB-23

9、1-NC）相比， MDA-MB-231-TET1細胞遷移能力顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。
　　5 TranswellTM小室檢測腫瘤細胞侵襲能力，與空白對照（ MDA-MB-231）及陰性對照組（ MDA-MB-231-NC）相比， MDA-MB-231-TET1細胞侵襲能力顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。
　　6倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，過表達TET1的MDA-MB-231-TET1細胞形態(tài)

10、并未發(fā)生明顯變化，進一步檢測EMT相關(guān)分子標志物發(fā)現(xiàn)：
　　Western blot法：與陰性對照組及空白對照組細胞相比， MDA-MB-231-TET1組細胞E-cadherin表達升高（P<0.001），N-cadherin、Vimentin表達降低（P<0.05），β-catenin表達降低（P<0.001），差異均有統(tǒng)計學意義。
　　免疫熒光法：與陰性對照組及空白對照組細胞相比， MDA-MB-231-TET1組細胞

11、 E-cadherin表達明顯升高， N-cadherin、Vimentin表達降低，MDA-MB-231-TET1組、陰性對照組及空白對照組細胞的細胞漿和細胞核均有β-catenin表達，但相較于 MDA-MB-231-TET1組細胞，陰性對照組及空白對照組細胞的細胞核內(nèi)β-catenin表達升高，提示其向核內(nèi)轉(zhuǎn)移。
　　7、動物實驗觀察荷瘤裸鼠大小，結(jié)果顯示，接種MDA-MB-231-TET1組細胞的裸鼠腫瘤大小與對照組無明顯