1、目的：(1)分別采用免疫組織化學(xué)法(IHC)和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)乳腺癌患者組織及血清中HMGB1表達(dá)情況，探討其表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系及其在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制。(2)觀察小于擾RNA(smallinterfering RNA，siRNA)抑制或下調(diào)HMGB1基因表達(dá)后對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞生物學(xué)行為的影響如何。(3)觀察重組HMGB1(rHMGB1)刺激人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB

2、-231后對(duì)細(xì)胞增殖、侵襲等生物學(xué)行為的影響及相關(guān)基因、蛋白的變化情況并初步探討其可能的下游信號(hào)通路。
　　方法：(1)采用IHC法分別檢測(cè)HMGB1在乳腺癌組織、癌旁正常乳腺對(duì)照組織以及乳腺良性疾病對(duì)照組中的表達(dá)水平;采用ELISA法分別檢測(cè)相對(duì)應(yīng)乳腺癌組、乳腺良性疾病對(duì)照組患者血清中HMGB1的表達(dá)水平，并統(tǒng)計(jì)學(xué)分析組織及血清HMGB1表達(dá)水平相關(guān)性及其與臨床常用病理學(xué)指標(biāo)之間的關(guān)系。(2)設(shè)計(jì)并化學(xué)合成針對(duì)HMGB1的3對(duì)s

3、iRNA分子序列(siRNA H1、siRNA H2、siRNA H3)，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組及陰性siRNA對(duì)照組。首先采用脂質(zhì)體法將siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞，然后通過(guò)RT-PCR和Western blot方法檢測(cè)HMGB1基因和蛋白表達(dá)水平的變化并記錄各siRNA的干擾效果;從中選擇出抑制作用最強(qiáng)的一組進(jìn)入后續(xù)細(xì)胞生物學(xué)行為影響研究，分別采用噻唑藍(lán)比色法(MTT)、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)及Transwell法檢測(cè)轉(zhuǎn)染HM

4、GB1-siRNA后MDA-MB-231細(xì)胞在增殖、周期、凋亡以及侵襲力等方面生物學(xué)行為的變化。(3)20ng/ml重組HMGB1(rHMGB1)及其抗體刺激MDA-MB-231細(xì)胞24h，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖變化、Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲力變化;逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)及Western blot法檢測(cè)其對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞核因子NF-κB/p65(nuclear factor kappa B/p65，NF

5、-κB/p65)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9mRNA和蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：(1)HMGB1在乳腺癌組織中表達(dá)水平明顯高于相對(duì)應(yīng)癌旁正常乳腺組織及乳腺良性疾病組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;組織中HMGB1的表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞分化高低、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移、腫瘤TNM分期等臨床常用參數(shù)密切相關(guān)，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;血清HMGB1含量在乳腺癌組亦明顯高于乳腺良性疾病組和正常志愿者對(duì)照組（P＜0.05），

6、但乳腺癌患者血清HMGB1表達(dá)水平與臨床常用參數(shù)并無(wú)相關(guān)，且腫瘤組織HMGB1高表達(dá)組與低表達(dá)組相比較，兩組血清HMGB1水平并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別（P＞0.05）。(2)3對(duì)特異性HMGB1-siRNAs轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞后，HMGB1mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.448±0.045、1.148±0.038、1.118±0.078，較空白對(duì)照組的1.393±0.070明顯減少（t值分別為25.393、6.878和5.867，P值均＜0

7、.01）;3對(duì)特異性HMGB1-siRNAs轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞后，HMGB1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.143±0.040、0.353±0.032、0.394±0.019，較空白對(duì)照組的0.600±0.064明顯減少（t值分別為13.540、7.718和6.900，P值均＜0.01），其中siRNA H1組抑制率約為70％，明顯高于其他組。與空白對(duì)照組相比，MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力在轉(zhuǎn)染siRNA H1后72h、96h、1

8、20h時(shí)受到顯著抑制，t值分別為7.130、30.972、25.679，P值均＜0.01，MTT檢測(cè)結(jié)果顯示:siRNA H1組細(xì)胞增殖率明顯低于空白對(duì)照組及陰性siRNA對(duì)照組（P＜0.01）;細(xì)胞周期分布結(jié)果顯示:siRNA H1組G0/G1期細(xì)胞所占比例明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)，而S期和G2/M期細(xì)胞所占比例則顯著下降(P＜0.01);細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示:siRNA H1組早期、中晚期細(xì)胞凋亡率及總凋亡率均顯著高于對(duì)照組(P＜

9、0.01);Transwell法結(jié)果顯示，siRNA-H1組細(xì)胞侵襲能力與空白對(duì)照組和陰性siRNA對(duì)照組相比有明顯下降（P＜0.01）。(3)MTT結(jié)果表明，MDA-MB-231細(xì)胞空白對(duì)照組與rHMGB1組、rHMGB1-抗體組、rHMGB1+IgG組、rHMGB1+rHMGB1-抗體組的吸光度分別為:0.266±0.038、0.712±0.039、0.283±0.030、0.709±0.022、0.201±0.027;重組HMGB

10、1組MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力明顯強(qiáng)于空白對(duì)照組(P＜0.05);20ng/mL重組HMGB1作用MDA-MB-231細(xì)胞24h后，NF-κB/p65及MMP-9mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.244±0.115、1.440±0.081，較MDA-MB-231細(xì)胞空白對(duì)照組NF-κB/p65及MMP-9mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.537±0.026、0.774±0.053顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;重組HMGB1作用MDA

11、-MB-231細(xì)胞24h后，NF-κB/p65、MMP-9蛋白相對(duì)含量分別為0.497±0.069、0.383±0.017，較空白對(duì)照組NF-κB/p65、MMP-9蛋白的相對(duì)含量0.402±0.050、0.294±0.014均明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。rHMGB1作用MDA-MB-231細(xì)胞24h后，Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，重組HMGB1組透膜細(xì)胞數(shù)為379±32個(gè)，相對(duì)應(yīng)空白對(duì)照組透膜細(xì)胞數(shù)則僅為204±2

12、6個(gè)，重組HMGB1組MDA-MB-231細(xì)胞侵襲力明顯增強(qiáng)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：(1)乳腺癌患者腫瘤組織以及血清中HMGB1均呈現(xiàn)高表達(dá)水平，且組織中表達(dá)水平與細(xì)胞分化程度高低、淋巴結(jié)有無(wú)轉(zhuǎn)移、腫瘤TNM分期等臨床常用參數(shù)呈密切相關(guān)，提示HMGB1作為輔助指標(biāo)，在乳腺癌診斷、預(yù)后判斷以及乳腺癌診斷篩查中具有一定價(jià)值。(2)HMGB1-siRNA技術(shù)可有效抑制HMGB1表達(dá)并對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞