1、目的:
　　亞臨床甲狀腺功能減退癥，簡稱為亞臨床甲減或者亞甲減(SCH)，是一種臨床上較為常見的隱匿性甲狀腺疾病。本研究首先使用抗甲狀腺藥物他巴唑(MMI)成功建立了一種新型亞臨床甲減小鼠型（SCH模型），然后評估了SCH模型小鼠全身代謝情況和脂代謝情況，在此基礎(chǔ)上又觀察了SCH模型小鼠肝臟ER stress反應(yīng)，最后對ER stress在亞甲減脂代謝紊亂中的可能作用機(jī)制進(jìn)行了探討。
　　1.建立一種新型的SCH小鼠模型。<

2、br>　　2.評估SCH模型小鼠的全身代謝相關(guān)情況和脂代謝情況。
　　3.評估亞SCH模型小鼠是否存在肝臟ER stress反應(yīng)。
　　4.探討ER stress與SCH模型小鼠脂代謝的相關(guān)關(guān)系。
　　方法:
　　1.SCH模型小鼠建立方法:應(yīng)用常用抗甲藥物MMI（0.08 mg/kg）飲水喂養(yǎng)C57BL/6小鼠，創(chuàng)立新型的SCH模型小鼠。MMI喂養(yǎng)12周，16周和20周時(shí)，采用I125標(biāo)記放射免疫方法檢測小鼠的

3、血清游離甲狀腺素(FT4)和游離三點(diǎn)原氨酸(FT3)水平;采取Elisa的方法測驗(yàn)小鼠血清TSH情況評估小鼠的血清甲狀腺功能。并檢測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)評估小鼠肝臟功能。
　　2.代謝情況評估:用TSE PhenoMaster動(dòng)物代謝測量分析系統(tǒng)（簡稱為動(dòng)物代謝籠系統(tǒng)）評估小鼠的物理活動(dòng)度、產(chǎn)熱情況、二氧化碳產(chǎn)量(VCO2)、耗氧量(VO2)、呼吸商(RQ)、飲食和基礎(chǔ)代謝率(BMR)等全身代謝情況。

4、
　　3.脂代謝情況檢測:檢驗(yàn)科檢測小鼠血脂;組織膽固醇含量分析試劑盒和組織甘油三酯含量分析試劑盒檢測小鼠肝臟組織脂質(zhì)（膽固醇和甘油三酯）含量;菲律賓(Filipin)染色評估小鼠肝組織膽固醇積聚狀況;油紅O染色評估小鼠肝組織脂質(zhì)積聚狀況。Real-time PCR的方法檢測小鼠重要臟器——肝臟的脂質(zhì)合成及脂代謝樞紐分子的表達(dá)狀況。
　　4.小鼠肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激情況檢測:采取Western Blot法測驗(yàn)肝臟ER stress

5、三條通路蛋白的表達(dá)狀況:Bip的蛋白變化，磷酸化IRE1α和總IRE1α的蛋白水平變化，XBP1u（未剪接體形式）和XBP1s（剪接體形式）的蛋白水平程度變化，磷酸化的eif2α和總eif2α蛋白水平的變化，以及ATF6α的蛋白水平變化。
　　5.細(xì)胞培養(yǎng)驗(yàn)證:不同濃度梯度的TSH和陽性對照衣霉素（TM，ER stress激動(dòng)劑）培養(yǎng)HepG2細(xì)胞株6小時(shí)，觀察TSH對HepG2細(xì)胞的直接作用，能否導(dǎo)致細(xì)胞ER stress反應(yīng)。

6、采取Western Blot法檢驗(yàn)細(xì)胞中Bip的表達(dá)程度變化，磷酸化IRE1α和總IRE1α的表達(dá)程度變化，XBP1u（未剪接體形式）和XBP1s（剪接體形式）的表達(dá)程度變化。
　　6.4-PBA改善SCH模型小鼠的脂代謝紊亂:4-苯基丁酸（4-PBA，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的化學(xué)阻斷劑）注射亞臨床甲減小鼠4周后，評估各組小鼠肝臟ER stress的情況，同時(shí)檢測相關(guān)脂代謝情況和脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.S

7、CH小鼠模型的建立:0.08 mg/kg·d MMI飲水喂養(yǎng)C57BL/6小鼠分別造模12周，16周，20周時(shí)，取血檢驗(yàn)小鼠血清甲功指標(biāo)。發(fā)現(xiàn)在MMI喂養(yǎng)小鼠12周時(shí)，模型組小鼠血清FT4、FT3測值與對照組小鼠相比無明顯差異性的變化(P＞0.05);血清TSH水平模型組明顯高于對照組小鼠(P＜0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述變化符合亞臨床甲減的臨床特點(diǎn)和診斷標(biāo)準(zhǔn)，說明在MMI飲水喂養(yǎng)C57BL/6小鼠12周時(shí)，已經(jīng)建立成了SCH模

8、型。MMI喂養(yǎng)16周時(shí)，模型組小鼠仍然保持著亞臨床甲減的狀態(tài)。而在MMI喂養(yǎng)20周時(shí)，模型組小鼠血清FT4水平明顯低于對照組小鼠(P＜0.05)，說明模型組小鼠進(jìn)入臨床甲減狀態(tài)。MMI造模時(shí)，模型組小鼠亞甲減狀態(tài)大約持續(xù)8周。
　　2.SCH模型小鼠全身代謝情況評估:選用MMI喂養(yǎng)16周SCH模型小鼠，放入代謝籠系統(tǒng)監(jiān)測其全身代謝情況。發(fā)現(xiàn)與對照組對比后，SCH模型小鼠的活動(dòng)度、VCO2、VO2、RQ、產(chǎn)熱量和BMR均無明顯不同(

9、P＞0.05)。這與亞甲減病人臨床特征相符:與甲狀腺機(jī)能正常人對比，無明顯代謝差異，不表現(xiàn)出明顯的低代謝特點(diǎn)。
　　3.SCH小鼠脂質(zhì)代謝紊亂:與對照組相比，MMI喂養(yǎng)12周SCH模型小鼠的血脂譜和肝臟TC含量無顯明差異;但此時(shí)肝臟甘油三酯含量增加(P＜0.05);肝組織切片油紅O染色亦表明5CH模型小鼠脂質(zhì)積聚較對照組增長。與對照組對比后發(fā)現(xiàn)，MMI喂養(yǎng)16周SCH模型小鼠血清TC，LDL-C和TG水平均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義地增長(P＜

10、0.05);肝臟膽固醇含量(p＜0.05)和肝臟甘油三酯含量(p＜0.05)均明顯增加;菲律賓(Filipin)染色和油紅O染色結(jié)果也與上述數(shù)據(jù)相符合。PCR的結(jié)果顯示，在SCH模型小鼠中，肝臟膽固醇合成關(guān)鍵基因SREBP2、HMGCR表達(dá)增高(P＜0.05)而膽固醇轉(zhuǎn)化主要因子CYP7A1、HNF4α的表達(dá)下降(P＜0.05);肝甘油三酯合成代謝關(guān)鍵基因SREBP1C和PPARα的mRNA表達(dá)上升(P＜0.05)，脂肪酸氧化限速酶CP

11、T1α表達(dá)同樣增強(qiáng)(P＜0.05)。
　　4.肝細(xì)胞ER stress情況評估:SCH模型小鼠肝臟Bip、磷酸化IRE1α、及其下游XBP1s（剪接體形式）的蛋白表達(dá)皆比對照小鼠組顯明增長(P＜0.05)，而其他通路中關(guān)鍵分子則無明顯變化。說明亞臨床甲減能夠激發(fā)小鼠肝臟ERstress，且可能主要是通過激發(fā)IRE1α/XBP1 s通路起作用。為了進(jìn)一步說明ER stress是由TSH升高導(dǎo)致的，本研究又采用不同濃度TSH刺激Hep

12、G2細(xì)胞同時(shí)選用TM作為陽性對照，發(fā)現(xiàn)TSH刺激HepG2細(xì)胞6小時(shí)后，Bip、磷酸化IRE1α、及其下游XBP1s的蛋白表達(dá)均較對照組明顯增加(P＜0.05)，且對于此種刺激作用存在有顯著劑量依賴性的特點(diǎn)。
　　5.ER stress有可能于亞臨床甲減中的脂代謝紊亂中施展樞紐作用:應(yīng)用ERstress阻斷劑4-PBA給SCH模型小鼠連續(xù)注射4周后，發(fā)現(xiàn)SCH模型小鼠的脂代謝紊亂狀態(tài)明顯改善:血脂調(diào)整至正常程度，肝臟TC含量和肝臟

13、TG含量也較未注射4-PBA的SCH小鼠顯著下降(P＜0.05)，肝組織切片的菲律賓(Filipin)染色和油紅O染色也與上述結(jié)果相一致。TG代謝和TC代謝的關(guān)鍵基因在分子轉(zhuǎn)錄水平也發(fā)生了相宜的程度變化。說明ER stress很可能在亞甲減伴隨的脂代謝紊亂中發(fā)揮重要作用，當(dāng)糾正了亞臨床甲減的ERstress后，脂代謝紊亂明顯改善。
　　結(jié)論:
　　1.應(yīng)用MMI飲水喂養(yǎng)C57BL/6可以創(chuàng)立一種新型非侵入性、簡單易行的SCH