1、目的：阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（OSAHS），是一種發(fā)病率較高的睡眠呼吸障礙性疾病，同時也是神經(jīng)系統(tǒng)認知功能障礙發(fā)生發(fā)展的重要危險因素。間歇低氧（IH）作為 OSAHS主要的病理生理學特征，其反復發(fā)生的低氧/復氧過程可以誘導海馬神經(jīng)細胞損傷。認知功能障礙作為老年OSAHS患者常見并發(fā)癥，其發(fā)生機制可能與間歇低氧所致海馬神經(jīng)細胞損傷有關。自噬是維持細胞穩(wěn)態(tài)的重要生理機制，近年來有研究發(fā)現(xiàn)自噬在缺血/缺氧所致系統(tǒng)性損傷中發(fā)揮重要作用。

2、然而在間歇低氧條件下，自噬激活的具體機制以及自噬對神經(jīng)系統(tǒng)損傷的影響目前尚未清楚闡明。因此，本研究通過模擬人OSAHS建立間歇低氧模型，從體外實驗角度觀察間歇低氧損傷后海馬神經(jīng)細胞自噬的表達，并進一步通過藥物干預檢測間歇低氧所致海馬神經(jīng)細胞自噬流量的變化，擬探討自噬的激活在間歇低氧所致海馬神經(jīng)細胞損傷中的作用。
　　方法：取新生 SD乳鼠（24小時內(nèi)）海馬組織進行原代神經(jīng)細胞培養(yǎng)，至第7天，采用免疫熒光對海馬神經(jīng)元進行鑒定。①建立

3、不同時間段的間歇低氧細胞模型，設正常對照組（NC）、間歇低氧組（IH）4h、間歇低氧組8h和間歇低氧組12h。間歇低氧組分別循環(huán)給予氧濃度為1.5％的低氧5min和21%的常氧10min處理4h、8h和12h，正常對照組持續(xù)給予氧濃度為21%的常氧。采用免疫熒光和免疫印跡檢測間歇低氧不同時間段內(nèi)自噬特異性微管相關蛋白輕鏈3（LC3）、Beclin1和活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cleaved caspase-3）蛋白的表達，TUN

4、EL法檢測不同時間段內(nèi)海馬神經(jīng)細胞凋亡的變化。②給予自噬激活劑雷帕霉素和抑制劑氯喹預處理后再建立間歇低氧細胞模型，設正常對照組、間歇低氧組（12h）、藥物預處理組、單獨給藥組和饑餓組。間歇低氧組于間歇低氧艙內(nèi)處理12h；藥物預處理組分別給予雷帕霉素和氯喹稀釋液預處理12h后，再置于間歇低氧艙內(nèi)暴露12h；單獨給藥組分別給予雷帕霉素和氯喹處理12h；饑餓組即間歇低氧陽性對照組給予EBSS無糖培養(yǎng)液培養(yǎng)12h。采用免疫印跡檢測各實驗組自噬相

5、關蛋白LC3-I向LC3-II的轉化，即LC3-II/LC3-I和P62蛋白的表達。③實驗模型的建立及實驗分組同步驟②。采用免疫印跡檢測各實驗組自噬相關蛋白LC3-II和cleaved caspase-3的表達，免疫熒光檢測各實驗組LC3蛋白表達，TUNEL檢測各實驗組海馬神經(jīng)細胞凋亡的變化。
　　結果：①間歇低氧對新生鼠原代海馬神經(jīng)細胞自噬相關蛋白表達的影響：間歇低氧組自噬相關蛋白LC3和Beclin1表達明顯增多，且隨著間歇低

6、氧時間的延長LC3和Beclin1表達也逐漸增多。間歇低氧12h表達最多，與正常對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（**P<0.05）。②間歇低氧對新生鼠原代海馬神經(jīng)細胞自噬流量的影響：與正常對照組相比，間歇低氧組LC3-II/LC3-I表達顯著增多，而P62蛋白表達則明顯降低，差異均具有統(tǒng)計學意義（**P<0.05）；與雷帕霉素單獨給藥組相比，雷帕霉素+間歇低氧組LC3-II/LC3-I表達顯著增高，而P62蛋白表達則明顯降低，差異均具有

7、統(tǒng)計學意義（**P<0.05）；與氯喹單獨給藥組相比，氯喹+間歇低氧組LC3-II/LC3-I表達顯著增高，P62蛋白表達則明顯降低，差異均具有統(tǒng)計學意義（***P<0.05）；與正常對照組和DMSO組相比，雷帕霉素單獨給藥組 LC3-II/LC3-I表達顯著增高，差異具有統(tǒng)計學意義（*P<0.05，**P<0.05），而DMSO組與正常對照組相比LC3-II/LC3-I表達無顯著差異；與正常組相比，EBSS組LC3-II/LC3-I表

8、達顯著增高，而P62蛋白表達則顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（*P<0.05），但與間歇低氧組相比，LC3-II/LC3-I和P62表達均無明顯差異。③干預自噬流量對間歇低氧所致海馬神經(jīng)細胞凋亡的影響：間歇低氧組凋亡陽性細胞數(shù)和cleaved caspase-3表達明顯增高，且隨著IH時間的延長，二者表達也逐漸增多。間歇低氧12h表達最多，與正常對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（**P<0.05）；雷帕霉素+間歇低氧組cleaved cas

9、pase-3表達和凋亡陽性細胞表達顯著高于間歇低氧組。而氯喹+間歇低氧組cleaved caspase-3表達和凋亡陽性細胞數(shù)目較間歇低氧組明顯減少，差異均具有統(tǒng)計學意義（**P<0.05，***P<0.05）；雷帕霉素單獨給藥組cleaved caspase-3蛋白表達和凋亡陽性細胞數(shù)目顯著高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（*P<0.05），但DMSO組與正常對照組相比cleaved caspase-3表達無顯著差異。
　　結