1、幾丁質(zhì)（chitin）是由N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖通過β-1，4-糖苷鍵連接起來的直鏈多聚物，是最豐富的天然高分子化合物之一，廣泛分布于動(dòng)物、植物及微生物體內(nèi)。幾丁質(zhì)酶可以水解幾丁質(zhì)產(chǎn)生幾丁寡糖和N-乙酰氨基葡萄糖，且廣泛存在于自然界的生物中。近年來，隨著幾丁質(zhì)酶的降解產(chǎn)物在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)、環(huán)保、造紙、化工等領(lǐng)域的應(yīng)用越來越深入，幾丁質(zhì)酶作為制備幾丁寡糖的重要工具越來越受到人們的重視。
　　 國(guó)內(nèi)外已篩選出多種幾丁質(zhì)酶生產(chǎn)

2、菌，并將其分離提純。但是，直接由真菌發(fā)酵產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶在工業(yè)化生產(chǎn)中受多方面因素的限制，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們已不滿足于從原始產(chǎn)生生物中提取和利用幾丁質(zhì)酶，而是希望得到編碼這種酶的基因并轉(zhuǎn)入宿主進(jìn)行高效低成本的表達(dá)。因此利用重組微生物實(shí)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶的工業(yè)化生產(chǎn)、提高幾丁質(zhì)酶活性和產(chǎn)量，是目前較為理想的方法。
　　 嗜熱子囊菌原變種（Thermoascus aurantiacus var.aurantiacus）是一種廣泛分布

3、的，生長(zhǎng)上限溫度較高的嗜熱真菌，能夠在45℃～50℃的高溫下很好的繁殖生長(zhǎng)。本研究根據(jù)真菌幾丁質(zhì)酶的同源保守序列設(shè)計(jì)兼并引物，通過RT-PCR和Tail-PCR等技術(shù)首次從嗜熱子囊菌原變種中分離得到了一種幾丁質(zhì)酶基因Chit-TAA，全長(zhǎng)DNA為1826bp，在包含一個(gè)由1191個(gè)核苷酸構(gòu)成的開放閱讀框，編碼396個(gè)氨基酸，該基因cDNA在GenBank中的登錄號(hào)為GU338053。序列比對(duì)分析表明，該蛋白屬于糖苷水解酶18家族幾丁質(zhì)酶

4、，其中兩個(gè)序列S-GGW和DG-D-DWE非常保守。這兩段保守氨基酸序列與糖基水解酶（glycosylhydrolases）18家族催化活性有關(guān)。其中不變氨基酸殘基Asp和Glu為幾丁質(zhì)酶的催化活性位點(diǎn)。利用基因重組的方法構(gòu)建酵母分泌型表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中。于MD/MM平板上篩選His+Mut+表型的酵母轉(zhuǎn)化子，經(jīng)過PCR檢測(cè)及G418抗性篩選得到多拷貝整合子，進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)。通過檢測(cè)各轉(zhuǎn)化子每隔24h的蛋白表達(dá)情況來篩選高效

5、表達(dá)目的幾丁質(zhì)酶的工程菌株，篩選到表達(dá)酶活性最高的菌株GS-Chit-176。在甲醇的誘導(dǎo)下，重組蛋白得到了高效表達(dá)，第6天的表達(dá)量最高，達(dá)到0.433mg/mL，酶活力為7.25U/mL，同時(shí)對(duì)表達(dá)的幾丁質(zhì)酶進(jìn)行了純化，SDS-PAGE檢測(cè)該蛋白的分子量為43.9kDa。該幾丁質(zhì)酶的最適反應(yīng)溫度為60℃，最適反應(yīng)pH值為8.0，70℃處理30min仍有45％的相對(duì)酶活，具有較好的熱穩(wěn)定性。對(duì)其降解產(chǎn)物的研究表明，該幾丁質(zhì)酶降解膠體幾丁

6、質(zhì)的主要產(chǎn)物為幾丁質(zhì)二糖。而且該酶對(duì)煙草赤星病菌（Alternaria alternta）、串珠鐮刀菌（Fusarium moniliforme）的菌絲生長(zhǎng)也有一定的抑制作用，對(duì)玉蜀黍平臍蠕孢（Bipolaris maydis）的孢子萌發(fā)有一定的抑制作用。
　　 嗜熱子囊菌原變種幾丁質(zhì)酶基因能在畢赤酵母中分泌表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物具有優(yōu)良特性，這就預(yù)示了表達(dá)幾丁質(zhì)酶在幾丁質(zhì)工業(yè)和生物學(xué)領(lǐng)域的廣闊應(yīng)用前景。因此，期望能對(duì)該基因進(jìn)行改造，或

7、進(jìn)一步優(yōu)化表達(dá)條件，獲得真正有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的酵母工程菌株。
　　 生物幾丁質(zhì)酶基因一般包含信號(hào)肽序列、催化域、富含絲蘇氨酸域、幾丁質(zhì)結(jié)合域、C端延伸域。底物結(jié)合域的存在提高了酶在底物表面的濃度，有助于酶的催化區(qū)對(duì)底物的水解。植物和細(xì)菌幾丁質(zhì)酶的CHBD序列與纖維素酶的結(jié)合域（CBD）序列有較高的相似性，而且纖維素和幾丁質(zhì)都是通過β-1，4糖苷鍵連接起來的直鏈多聚物，結(jié)構(gòu)及其相似。本研究利用融合PCR技術(shù)分別在嗜熱子囊菌幾丁質(zhì)酶T

8、achit的C端和N端引入嗜熱毛殼菌（Chaetomium thermophilum）纖維素酶chh1、cbh2的CBD結(jié)構(gòu)域，構(gòu)建表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母中，篩選到兩株高表達(dá)量的酵母工程菌株。表達(dá)的融合蛋白Tachit-CBD1和CBD2-Tachit對(duì)膠體幾丁質(zhì)的活性分別提高了1.6倍和0.6，對(duì)粉狀幾丁質(zhì)的活性提高了0.9和0.3倍。而且表達(dá)的Tachit-CBD1和CBD2-Tachit同時(shí)還具有熱穩(wěn)定性，最適反應(yīng)溫度為都為60℃，

9、50℃條件下相對(duì)穩(wěn)定。最適反應(yīng)pH值都為8.0，在pH5.0～8.0之間穩(wěn)定。
　　 通過對(duì)Tachit催化區(qū)非保守氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變，構(gòu)建了兩個(gè)突變體Tachit-L129F和Tachit-V134I，通過比較Tachit-L129F的最適反應(yīng)溫度提高了10℃，而熱穩(wěn)定基本不變，最適反應(yīng)pH值為降為5.0，在酸性條件下穩(wěn)定；Tachit-V134I的性質(zhì)研究結(jié)果表明，突變對(duì)該酶最適反應(yīng)溫度的影響變化不大。對(duì)其最適反應(yīng)pH的測(cè)定