1、山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文疏棉狀嗜熱絲孢菌熱穩(wěn)定脂肪酶的基因克隆與表達(dá)姓名：鄭艷申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：微生物學(xué)指導(dǎo)教師：李多川20080615山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文中文摘要脂肪酶(1ipase，EC3113)，全稱三酰甘油?；饷福瑥V泛存在于生物體內(nèi)。它能夠催化油脂上甘油酯鍵的水解，也可催化酯交換、酯化、醇解和酸解等反應(yīng)。微生物來源的脂肪酶由于作用多樣、易于培養(yǎng)、產(chǎn)量豐富等特點(diǎn)而被廣泛用于工業(yè)生產(chǎn)，其中熱穩(wěn)定脂肪酶的研究和開發(fā)更是具

2、有重要的商業(yè)價(jià)值。疏棉狀嗜熱絲孢菌(Thermomyceslanuginosus)是一種分布廣泛、生長上限溫度較高的真菌。它能夠產(chǎn)生熱穩(wěn)定的具有重要工業(yè)價(jià)值的脂肪酶，但是野生菌產(chǎn)酶存在培養(yǎng)溫度高等較多不利因素，因而近年來主要研究方向集中于采用基因工程方法構(gòu)建重組菌，進(jìn)而表達(dá)獲得脂肪酶。本研究中T1anuginosus在添加橄欖油的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上產(chǎn)生了脂肪酶。根據(jù)已報(bào)道的脂肪酶同源保守序列，以及GenBank已注冊的T1anuginosus

3、脂肪酶序列(AF054513)設(shè)計(jì)特異引物，綜合運(yùn)用PCR、RTPCR、TailPCR技術(shù)克隆到兩個(gè)脂肪酶基因的全長DNA和cDNA序列，將兩個(gè)基因分別命名為匆和砌。其中匆基因DNA序列長1071bp，有3內(nèi)含子；cDNA序列長885bp，開放閱讀框編碼291個(gè)氨基酸，其中前17個(gè)氨基酸構(gòu)成信號肽，序列提交GenBank，登錄號分別為EU022703和EU370914。／n基因DNA序列長1209bp，含有3個(gè)內(nèi)含子；全長cDNA序列為

4、1095bp，包含一個(gè)編碼291個(gè)氨基酸的開放閱讀框，前17個(gè)氨基酸構(gòu)成信號肽。序列在Genbank中注冊，登錄號為EU004197和EU004196。比對分析由核苷酸序列推導(dǎo)的相應(yīng)氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)脂肪酶均具有GHSLG，即霉菌脂肪酶保守序列。二者氨基酸同源性為7869％。將基因匆和揚(yáng)分別與酵母分泌型表達(dá)載體pPIC9K雙酶切后體外連接，構(gòu)建酵母重組表達(dá)載體pPIC9K／／gy和pPIC9K／ln，并測序保證正確的閱讀框。將重組表達(dá)