1、目的:
　　腸癌居世界高發(fā)腫瘤第三位，嚴(yán)重威脅人類健康。盡管手術(shù)及輔助治療使一部分腸癌得到根治，但是仍有50％左右的患者會(huì)進(jìn)展為晚期。靶向治療是晚期腸癌的主要治療手段之一。研究表明，抗表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)單克隆抗體與化療聯(lián)合能顯著延長(zhǎng)腸癌患者的生存，而K-RAS基因狀態(tài)可成功地預(yù)測(cè)療效。但不容忽視的是，即使是K-RAS野生型的腸癌，也僅有55％-60％左右的患者能夠從抗EGFR單克隆抗體聯(lián)合化療中獲益，并且單藥有效率只有1

2、7％，提示除K-RAS突變狀態(tài)外，還有其他的耐藥機(jī)制存在。但非常遺憾的是，迄今為止，只有突變率很低的B-RAF及PIK3CA等分子被證實(shí)與臨床耐藥有關(guān)，大多數(shù)K-RAS野生型患者的耐藥機(jī)制仍是一團(tuán)迷霧。
　　抗EGFR單克隆抗體的耐藥機(jī)制涉及機(jī)體多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和靶點(diǎn)引起的多種變化，分為原發(fā)性耐藥和繼發(fā)性（獲得性）耐藥。既往認(rèn)為，原發(fā)性耐藥主要由于部分腫瘤細(xì)胞存在K-RAS或B-RAF等突變，使EGFR下游信號(hào)通路發(fā)生EGFR非依

3、賴性的異?；罨?。繼發(fā)性耐藥主要由于藥物長(zhǎng)期作用，誘導(dǎo)敏感腫瘤細(xì)胞過(guò)度表達(dá)耐藥分子，或者治療過(guò)程中敏感腫瘤細(xì)胞發(fā)生了新的基因突變，腫瘤誘導(dǎo)的、非依賴于EGFR的血管生成，EGFR自身或配體轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α過(guò)度表達(dá)，EGFR泛素化，EGFR核轉(zhuǎn)位，EGFR變異體Ⅲ(EGFRvⅢ)，EGFR同其它跨膜蛋白形成異源二聚體，非受體酪氨酸激酶Src家族激酶(Src famny kinase，SFK) c-Src間接活化EGFR通路，以及繞開(kāi)EG

4、FR通路的其它受體酪氨酸激酶的活化（如IGF-1R和HGF/MET通路）等。腫瘤源自宿主的正常細(xì)胞，經(jīng)過(guò)多步細(xì)胞轉(zhuǎn)化而癌變，經(jīng)過(guò)多次克隆選擇形成異質(zhì)性。不同的腫瘤細(xì)胞亞群具有差異性的基因表達(dá)譜、蛋白表達(dá)譜，形成各異的腫瘤微環(huán)境。由于腫瘤是一群異質(zhì)性很大的細(xì)胞混合體，同一個(gè)腫瘤病灶中的不同腫瘤細(xì)胞對(duì)抗EGFR單克隆抗體的敏感性并不完全一致，并且很可能對(duì)抗EGFR單克隆抗體耐藥性的產(chǎn)生具有重要作用。那么在結(jié)腸癌的治療中，攻擊單一、有限的靶標(biāo)

5、（及其作用通路）是否能夠消滅復(fù)雜的腫瘤？腫瘤異質(zhì)性是否限制了EGFR單克隆抗體的靶向性治療效果，誘導(dǎo)耐藥性的產(chǎn)生，目前并不清楚。
　　腫瘤微環(huán)境由腫瘤細(xì)胞、間質(zhì)組織和細(xì)胞外間質(zhì)構(gòu)成，提供了腫瘤細(xì)胞生存、增殖的土壤。在腫瘤微環(huán)境中不同細(xì)胞間通過(guò)分泌各種細(xì)胞因子、趨化因子、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白等，進(jìn)行細(xì)胞間信息傳遞。研究顯示腫瘤微環(huán)境中的成纖維細(xì)胞通過(guò)旁分泌表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)等，促進(jìn)

6、上皮性腫瘤惡性增殖。最新研究證實(shí)，腫瘤微環(huán)境中一些特定的生長(zhǎng)因子及細(xì)胞因子可通過(guò)抑制化療藥物誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡而誘導(dǎo)耐藥。這提示抗EGFR單克隆抗體耐藥的另一個(gè)可能的機(jī)制是，腸癌細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞間信息傳遞使敏感細(xì)胞發(fā)生耐藥。但究竟哪些耐藥信息被傳遞，如何傳遞等問(wèn)題并不清楚。本研究篩選一種西妥昔單抗耐藥細(xì)胞RKO及一種相對(duì)敏感細(xì)胞Caco-2，探討結(jié)腸腫瘤細(xì)胞間是否存在信息傳遞，這種信息傳遞能否誘導(dǎo)敏感的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥，并對(duì)其具體機(jī)制進(jìn)行了

7、深入探討。
　　材料與方法:
　　1、采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài);
　　2、采用超濾離心法制備濃縮的細(xì)胞上清;
　　3、采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增值能力;
　　4、采用Western blot檢測(cè)EGFR，p-EGFR，MET，p-MET，ERK，p-ERK，Akt，p-Akt，Actin蛋白的表達(dá);
　　5、采用細(xì)胞因子抗體芯片檢測(cè)細(xì)胞上清液的生長(zhǎng)因子;
　　6、采用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液生長(zhǎng)

8、因子的含量;
　　7、采用RT-PCR法檢測(cè)HGF的mRNA表達(dá)水平;
　　8、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示。采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)和Fisher精確計(jì)算概率法，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1、耐藥細(xì)胞RKO細(xì)胞上清可誘導(dǎo)敏感細(xì)胞Caco-2對(duì)西妥昔單抗產(chǎn)生耐藥
　　MTT法測(cè)定不同濃度西妥昔單抗處理結(jié)腸癌

9、caco-2、RKO細(xì)胞72h，結(jié)果顯示西妥昔單抗對(duì)RKO細(xì)胞無(wú)明顯抑制率（西妥昔單抗20μg/ml、作用72h時(shí)抑制率為3.33±1.70％），Caco-2細(xì)胞隨著西妥昔單抗?jié)舛鹊脑黾右种坡室搽S之增加（西妥昔單抗20μg/ml、作用72h時(shí)抑制率為29.58±5.52％）。分別用濃縮的低濃度及高濃度的RKO、caco-2細(xì)胞上清及西妥昔單抗處理caco-2細(xì)胞72h，結(jié)果顯示不同濃度的RKO細(xì)胞上清聯(lián)合西妥昔單抗處理組與西妥昔單抗單獨(dú)

10、處理組相比，細(xì)胞的生存率分別由76％升至102％和123％(P＜0.05)，而caco2上清聯(lián)合處理組無(wú)明顯變化。
　　2、耐藥細(xì)胞RKO細(xì)胞上清可誘導(dǎo)敏感細(xì)胞Caco-2細(xì)胞的MET、AKT、ERK活化
　　不同濃度的RKO、caco-2濃縮上清處理caco2細(xì)胞10min和1h，結(jié)果顯示，RKO細(xì)胞上清處理細(xì)胞10min后，MET是濃度依賴性的活化，1h開(kāi)始下調(diào)，同時(shí)下游信號(hào)通路ERK、AKT也均有明顯活化。而對(duì)照組及c

11、aco-2細(xì)胞上清處理組則無(wú)MET活化。
　　3、耐藥細(xì)胞RKO細(xì)胞可向上清里分泌HGF
　　為了解RKO細(xì)胞向上清里分泌了什么成分，使得Caco-2細(xì)胞對(duì)西妥昔單抗產(chǎn)生耐藥，我們用細(xì)胞因子抗體芯片檢測(cè)caco2、RKO細(xì)胞上清中生長(zhǎng)因子表達(dá)的差異，發(fā)現(xiàn)RKO細(xì)胞上清HGF的信號(hào)值為2192，而caco2細(xì)胞HGF的信號(hào)值為0。ELISA結(jié)果顯示RKO細(xì)胞向上清分泌的HGF含量為2.36ng/ml，而caco-2細(xì)胞向上清分

12、泌的HGF含量為0。RT-PCR結(jié)果顯示RKO細(xì)胞中HGF的mRNA水平顯著高于caco2細(xì)胞。
　　4、MET抑制劑PHA-665752可抑制RKO細(xì)胞上清誘導(dǎo)的p-MET活化，與西妥昔單抗聯(lián)用促進(jìn)調(diào)亡
　　選取常用的MET抑制劑PHA-665752(簡(jiǎn)稱PHA)，分別應(yīng)用PHA、西妥昔單抗及高濃度濃縮的RKO、Caco-2細(xì)胞上清作用到Caco-2細(xì)胞。MTT結(jié)果顯示單藥西妥昔單抗處理組抑制率為72.32±3.77％，R

13、KO細(xì)胞上清聯(lián)合西妥昔單抗處理組抑制率為146.56±9.90％，caco2細(xì)胞上清聯(lián)合西妥昔單抗處理組抑制率為80.09±0.96％，PHA單藥處理組抑制率為66.83±5.19，PHA聯(lián)合西妥昔單抗處理組抑制率為59.68±3.77％，RKO細(xì)胞上清聯(lián)合西妥昔單抗級(jí)PHA處理組抑制率為90.11±6.13％。觀察PHA對(duì)活化的MET通路的影響，可見(jiàn)PHA即可以明顯抑制由RKO細(xì)胞上清引起的MET磷酸化，也可以明顯抑制ERK、AKT磷