1、目的：
　　本研究以主要組織相容性復(fù)合體(maj or histocompatibility complex，MHC)完全不合的C57BL/6(H-2kb)小鼠、BALB/c(H-2kd)小鼠分別作為供受鼠，BU-Cy或Flu-BU為預(yù)處理方案，通過移植骨髓及脾細(xì)胞構(gòu)建小鼠急性GVHD模型。從急性GVHD小鼠的一般情況和急性GVHD臨床評(píng)分、生存期、組織病理、嵌合度、T細(xì)胞水平、B細(xì)胞水平和細(xì)胞因子水平等方面分析評(píng)價(jià)所建立的急性G

2、VHD模型，并初步比較兩種預(yù)處理方案誘發(fā)的小鼠急性GVHD的差異，以期為急性GVHD的發(fā)生機(jī)制及防治效果的臨床前研究提供一個(gè)更好的技術(shù)平臺(tái)。
　　方法：
　　1)雄性BALB/c(H-2kd)小鼠為受鼠，雌性C57BL/6(H-2kb)小鼠為供鼠，受鼠隨機(jī)分組后接受不同劑量的BU-Cy或Flu-BU預(yù)處理，48h后輸入2×107骨髓細(xì)胞及2×107脾細(xì)胞，確定最佳預(yù)處理劑量。
　　2)構(gòu)建小鼠急性GVHD模型。將受鼠隨

3、機(jī)分成8組，分別為:A組:同等飼養(yǎng)條件下正常BALB/c小鼠;B組:同等飼養(yǎng)條件下DMSO注射組，C組:BU-Cy預(yù)處理組，D組:BU-Cy預(yù)處理+移植同基因(BALB/c小鼠)骨髓及脾細(xì)胞組，E組:BU-Cy預(yù)處理+移植異基因（C57BL/6小鼠）骨髓及脾細(xì)胞移植組，F(xiàn)組:Flu-BU預(yù)處理組，G組:Flu-BU預(yù)處理+移植同基因(BALB/c小鼠)骨髓及脾細(xì)胞組，H組:Flu-BU預(yù)處理+移植異基因（C57BL/6小鼠）骨髓及脾細(xì)胞

4、移植組。預(yù)處理劑量為:BU100mg/kg-Cy200mg/kg或Flu500mg/kg-BU100mg/kg，輸入細(xì)胞數(shù)為:2×107骨髓細(xì)胞及2×107脾細(xì)胞。
　　3)記錄移植后小鼠一般情況、生存期，進(jìn)行急性GVHD臨床評(píng)分;HE染色檢測急性GVHD靶器官肝、脾、皮膚、腸等組織病變情況，并進(jìn)行病理評(píng)分;免疫組化檢測移植后小鼠肝、皮膚、小腸組織中cleaved-caspase3表達(dá)水平;流式細(xì)胞術(shù)檢測移植后小鼠脾臟和骨髓中嵌合

5、度;流式細(xì)胞術(shù)檢測移植后小鼠骨髓中CD3、CD19陽性細(xì)胞及供者源CD3、CD19陽性細(xì)胞比例，脾臟中CD4、CD8陽性細(xì)胞比例;ELISA檢測小鼠移植后+3d、+5d、+7d、+14d血清中IFN-γ、IL-4水平。并比較兩種預(yù)處理方案構(gòu)建的小鼠急性GVHD模型中上述指標(biāo)的差異。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示。應(yīng)用Kaplan-Meier方法

6、進(jìn)行生存分析，組間生存時(shí)間差異采用log rank檢驗(yàn)。BU-Cy與Flu-BU預(yù)處理后異基因移植小鼠間急性GVHD臨床評(píng)分、病理學(xué)評(píng)分比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn);組間IFN-γ、IL-4濃度，CD3+、CD19+、供者源CD3+、供者源CD19+、CD4+、CD8+細(xì)胞比例比較先用Shapiro-Wilk方法進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，服從正態(tài)分布后采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，若不服從正態(tài)分布則采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。P＜0

7、.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.BU100mg/kg-Cy200 mg/k預(yù)處理后異基因移植小鼠表現(xiàn)出急性GVHD典型臨床表現(xiàn)，且中位生存期為10 d，30 d內(nèi)全部死亡。Flu500mg/kg—BU100mg/kg預(yù)處理后異基因移植小鼠表現(xiàn)出急性GVHD典型臨床表現(xiàn)，且中位生存期23d，45d內(nèi)全部死亡。考慮到急性GVHD的觀察時(shí)間、均一性等問題，以此劑量作為最佳預(yù)處理劑量。
　　2.A、B組小鼠均無

8、進(jìn)食減少、體重下降等臨床表現(xiàn)。D、G組小鼠預(yù)處理后進(jìn)食減少、體重進(jìn)行性下降，移植后體重進(jìn)行性回升，均在移植后22d左右接近正常對(duì)照組水平。E組小鼠前7d體重進(jìn)行性下降，第8～12d體重基本維持不變，12d后體重再次開始下降，7d左右開始出現(xiàn)精神萎靡、活動(dòng)度減少、腹瀉、肛周紅腫、弓背、皺毛、脫毛等典型急性GVHD臨床表現(xiàn)，并于30d內(nèi)全部死亡。H組小鼠前8-9d體重持續(xù)下降，第9-12d體重基本維持不變，12d以后體重再度開始下降，7d左

9、右開始出現(xiàn)精神萎靡、活動(dòng)度減少、腹瀉、弓背、皺毛、脫毛等典型GVHD臨床表現(xiàn)，并于45 d內(nèi)全部死亡。按照GVHD臨床評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各組小鼠進(jìn)行臨床評(píng)分，第0d時(shí)所有小鼠臨床評(píng)分均為0分;+7d時(shí)E組小鼠評(píng)分（2.8±0.20分）和H組小鼠評(píng)分(3.2±0.49分)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.606);+14d、+21d、+28d時(shí)E組小鼠評(píng)分（5.5±0.29、6.0±0.00、7.0±0.00分）均較H組小鼠評(píng)分(3.75±0.25、4.0±

10、0.00、4.67±0.33分)高(P=0.017、P=0.046、P=0.034)。
　　3.A組、B組、D組、G組小鼠均長期生存，生存期超過45 d。E組小鼠中位生存期為10d，30 d內(nèi)全部死亡。H組小鼠中位生存期為23d，45d內(nèi)全部死亡。E組與H組比較，H組小鼠生存期明顯延長(x2=6.34，P=0.012)。
　　4.E組和H組小鼠移植后+14d急性GVHD主要靶器官肝、脾、皮膚、腸和肺組織HE染色均可見正常組織

11、結(jié)構(gòu)被不同程度破壞，炎癥細(xì)胞浸潤等急性GVHD病理征象。肝臟組織病理學(xué)評(píng)分E組(6.67±0.58分)較H組（3.67±0.58分）高(P=0.043);小腸組織病理學(xué)評(píng)分E組（6.67±0.58分）較H組（4.00±1.00分）高(P=0.046)，脾臟組織病理學(xué)評(píng)分E組（2.67±0.58分）和H組（2.67±0.58分）無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=1.0);皮膚組織病理學(xué)評(píng)分E組（3.67±0.58分）較H組（5.67±0.58分）低(P=

12、0.043)。
　　5.E組和H組小鼠移植后+14d肝臟、小腸組織均可見Cleaved-caspase3的表達(dá)，而皮膚Cleaved-caspase3表達(dá)不明顯。E組和H組相比，E組小鼠肝臟和小腸組織中Cleaved-caspase3表達(dá)量均較高。
　　6.E組小鼠移植后+14d脾臟和骨髓中嵌合度分別為90.30％±4.22％、95.55％±2.42％，均達(dá)到完全供者嵌合。H組小鼠移植后+14d脾臟和骨髓中嵌合度分別為92.

13、59％±4.05％、98.76％±0.30％，均達(dá)到完全供者嵌合，提示供者C57BL/6(H-2Kb)小鼠的骨髓細(xì)胞在受者BALB/c(H-2Kd)小鼠體內(nèi)植入成功。且差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.44，p=0.12)。
　　7.E組和H組小鼠移植后+14d骨髓中CD3+細(xì)胞比例較A組(6.77％±1.02％)均明顯升高(P=0.000、P=0.000)、CD19+細(xì)胞比例較A組(68.93％±4.48％)均明顯降低(P=0.000

14、、P=0.000)，脾臟中CD4+細(xì)胞較A組(27.60％±3.64％)均明顯下降(P=0.025、P=0.004)、脾臟中CD8+細(xì)胞較A組(7.37％±0.93％)均明顯升高(P=0.000、P=0.000);移植后+14d E組小鼠骨髓中CD3+細(xì)胞比例(73.97％±5.37％)較H組小鼠(53.37％±3.31％)明顯升高(t=5.66，P=0.005)，但其中H組供者來源的CD3+比例更高(t=21.8，P=0.000)。移

15、植后+14d E組小鼠骨髓中CD19+細(xì)胞比例(15.73％±2.75％)較H組(7.47％±1.00％)高(t=4.90，P=0.008)，其中供者來源CD19+比例E組更高(t=13.46，P=0.000)。移植后+14d E組小鼠脾臟中CD4+細(xì)胞比例(17.02％±3.76％)與H組CD4+細(xì)胞比例(12.57％±2.25％)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=1.76，P=0.154);移植后+14d E組小鼠脾臟中CD8+細(xì)胞比例(28.84

16、％±1.54％)與H組CD8+細(xì)胞比例(27.27％±2.21％)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=1.01，P=0.37)。
　　8.A組小鼠血清中IFN-γ濃度為20.23±2.01 pg/ml。E組和H組小鼠血清中IFN-γ濃度在移植后+5d較A組明顯升高(P=0.000、P=0.002)，均達(dá)到最高水平1607.78±119.53 pg/ml、959.04±116.09 pg/ml，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.83，P=0.001);+7

17、d和+14d時(shí)E組IFN-γ濃度仍比H組高(t=13.16，P=0.001; t=9.92，P=0.002)。A組小鼠血清中IL-4濃度為8.60±0.78 pg/ml。E組（5.13±0.09 pg/ml）和H組（10.14±0.73 pg/ml）小鼠血清中IL-4濃度均在移植后+5d下降至較低值，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.83，P=0.007);+7d時(shí)E組11-4濃度仍低于H組小鼠(t=3.55，P=0.038)，而到+14d

18、時(shí)二者無顯著性差異(t=2.68，P=0.075)。
　　結(jié)論：
　　本研究分別采用BU-Cy、Flu-BU預(yù)處理成功構(gòu)建了C57BL/6→BALB/c小鼠異基因移植急性GVHD模型。以Flu-BU預(yù)處理建立的小鼠急性GVHD模型生存期較長，急性GVHD臨床表現(xiàn)輕，肝臟、腸道病理改變較輕，這可能與其降低了血清中IFN-γ濃度、升高了血清中IL-4濃度有關(guān);并且骨髓中供者源T細(xì)胞浸潤更明顯、B細(xì)胞生成障礙更嚴(yán)重。然而這兩種預(yù)處