1、目的:以含有人可溶性腫瘤壞死因子受體Ⅰ(sTNFRⅠ)的慢病毒表達載體感染未成熟樹突狀細胞(imDC),對其進行鑒定并檢測sTNFRⅠ蛋白的表達以及刺激淋巴細胞增殖能力,并通過淋巴瘤細胞白血病小鼠模型,觀察其對異基因骨髓移植中移植物抗宿主病(GVHD)和移植物抗白血病效應(yīng)(GVL)的調(diào)控作用。
　　 方法:
　　 1、中量提取重組質(zhì)粒sTNFRⅠ,載體質(zhì)粒pXZ9,包裝質(zhì)粒ANRF及包膜質(zhì)粒pVSVG,采用陽離子脂質(zhì)體法

2、共轉(zhuǎn)染293 FT細胞,在轉(zhuǎn)染后48、72、96 h收集上清,獲得攜帶sTNFRⅠ基因的重組慢病毒及含空載體pXZ9的慢病毒。取BALB/c小鼠骨髓單個核細胞以1640完全培養(yǎng)基(GM-CSF20 ng/mL;IL-410ng/mL)培養(yǎng)樹突狀細胞(DC),并以細菌脂多糖(LPS)刺激使其成熟,光鏡下觀察細胞形態(tài),流式細胞術(shù)檢測細胞表型。以收獲的兩種慢病毒感染樹突狀細胞,通過EGFP報告基因的表達檢測感染率,以Western blot檢

3、測細胞中sTNFRⅠ蛋白的表達,通過CCK-8法進行淋巴細胞增殖能力的檢測。
　　 2、復(fù)制C57BL/6小鼠淋巴瘤細胞白血病模型,將sTNFRⅠ基因修飾的DC輸入異基因骨髓移植小鼠體內(nèi),并設(shè)立對照組。實驗分組如下:①A組:單純?nèi)碚丈?TBI)組;②B組:淋巴瘤細胞白血病發(fā)病組;③C組:Allo-BMT組(異基因骨髓移植對照組);④D組:pXZ9-DC組:⑤E組:sTNFRⅠ-DC組。通過受鼠GVHD臨床評分、組織病理學、異基

4、因嵌合體、白血病的發(fā)病率、存活率、生存期及血清細胞因子水平等,觀察輸注sTNFRⅠ基因修飾的未成熟DC對異基因骨髓移植小鼠GVHD及GVL的影響。
　　 結(jié)果:
　　 ①小鼠骨髓單個核細胞在培養(yǎng)24 h后大部分貼壁生長,僅見少量懸浮細胞。第7 d的DC低表達ⅠA/ⅠE,CD86,LPS刺激的成熟DC高表達ⅠA/ⅠE、CD86,無論是成熟還是未成熟DC均高表達CD11c。流式細胞術(shù)檢測兩種慢病毒對DC的感染率分別為54.5

5、8％以及46.67％,體外混合淋巴細胞培養(yǎng)結(jié)果提示sTNFRⅠ轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC刺激淋巴細胞的增殖能力較pXZ9轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC及LPS刺激的成熟DC減低(P＜0.05),pXZ9轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC較LPS刺激的成熟DC增殖力亦減低(P＜0.05)。Westem blot法檢測到含目的基因的病毒感染的DC中有sTNFRⅠ蛋白的表達,而對照組未檢測到。
　　 ②A組10只TBI小鼠均于10 d內(nèi)死于骨髓衰竭;B組小鼠均死于淋巴瘤細胞白血病;C、D和E組

6、小鼠均有急性GVHD和白血病的發(fā)病,D組小鼠生存期較C組延長(P＜0.05),E組小鼠生存期較C、D組延長(P＜0.05),20％的小鼠生存期超過30 d。
　　 ③GVHD評分E組較C、D組降低(P＜0.05),D組較C組降低(P＜0.05)。
　　 ④B、C、D和E組小鼠均有白血病的發(fā)病,B組白血病發(fā)病率100％,較C、D和E組高,C、D、E各組問比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 ⑤移植后C、D和E組

7、小鼠IFN-γ、IL-2濃度逐漸升高,C組小鼠IL-4降低,而D、E組濃度升高,各組間比較均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 ⑥移植后18 d,C、D和E組小鼠異基因嵌合率達95％～100％。
　　 結(jié)論:
　　 ①經(jīng)含sTNFRⅠ的慢病毒感染未成熟DC后,sTNFRⅠ的蛋白穩(wěn)定地表達,sTNFRⅠ可以維持DC于非成熟型狀態(tài);
　　 ②過繼輸注sTNFRⅠ基因修飾的未成熟DC延長了異基因骨髓移植小鼠的