1、目的:樹突狀細胞（dendriticcell，DC）是迄今發(fā)現(xiàn)惟一能刺激初始T細胞活化增殖的抗原遞呈細胞(antigenpresentingcell，APC)，也是體內最主要的抗原遞呈細胞。既往認為DC是特異性免疫應答的啟動者，但近年來研究發(fā)現(xiàn)DC在免疫調節(jié)中發(fā)揮免疫應答和免疫耐受的雙重作用。根據(jù)成熟程度，將DC分為未成熟DC(immatureDC，imDC)和成熟DC(matureDC，mDC)。mDC可以激活T淋巴細胞誘導免疫應答，

2、而imDC不能活化T淋巴細胞，但具有較強的抗原攝取及處理能力。最近的研究表明imDC可誘導免疫耐受，其機制有清除T細胞、誘導T細胞免疫無能和誘導調節(jié)性T細胞的產(chǎn)生?；趇mDC的特性，近年來將imDC用于T細胞介導的自身免疫性疾病的研究越來越得到重視。因此，能夠準確、高效的分離培養(yǎng)出imDC并對其進行鑒定是運用imDC開展下游實驗的前提與基礎。
　　 本研究旨在用rmGM-CSF、rmIL-4體外誘生小鼠骨髓源未成熟樹突狀細胞，

3、并運用免疫磁珠分離的方法純化所獲得的imDC，并從形態(tài)學、細胞表面分子的表達及對同種異基因T細胞的刺激增值能力三個方面對imDC進行鑒定，對小鼠骨髓源未成熟樹突狀細胞的體外分離培養(yǎng)、純化和鑒定方法進行探討和改良。
　　 方法:
　　 1小鼠骨髓源性未成熟DC的體外誘導及培養(yǎng)
　　 用拉頸法處死C57/B6小鼠，用75％乙醇與碘伏消毒后，無菌條件下取出下肢骨并去除周圍組織，在長骨兩端打孔使骨髓腔聯(lián)通并暴露骨髓，用適

4、量RPMI-1640培養(yǎng)液沖出骨髓，使用200目濾網(wǎng)過濾雜質并收集細胞后加入紅細胞裂解液。裂解紅細胞完畢后用RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌細胞，然后用細胞培養(yǎng)液(含10％胎牛血清、RPMI-1640、rmGM-CSF(10ng/ml)、rmIL-4(10ng/ml))調整細胞濃度到106/ml。6孔培養(yǎng)板中每孔加入4ml上述液體，將培養(yǎng)板放入37℃、含5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于第48小時更換培養(yǎng)液，于第96小時補充培養(yǎng)液，至第5天收集所

5、有懸浮細胞，用所得細胞進行下一步實驗。
　　 2分離純化imDC
　　 計數(shù)后將imDC重懸于緩沖液中并加入CD11c免疫磁珠，于4℃冰箱內孵育15分鐘后重懸。利用磁珠分選器分選，將磁珠標記的細胞懸液置入分選柱中，收集流出物，此為未標記的陰性細胞。然后收集分選柱中的CD11c+細胞，此即為純化后的imDC。
　　 3小鼠骨髓源未成熟樹突狀細胞的鑒定
　　 3.1細胞形態(tài)學觀察
　　 在倒置熒光顯微

6、鏡、掃描電鏡、透射電鏡下對imDC進行觀察。
　　 3.2流式細胞術檢測細胞表面分子
　　 將培養(yǎng)板中的懸浮細胞收集至離心管中，做流式細胞檢測前處理并加入抗體孵育。檢測imDC表面MHC-Ⅱ、CD11c、CD80、CD86分子的表達情況。
　　 3.3采用細胞增殖檢測試劑法（CCK-8法）檢測imDC對同種異基因T細胞刺激增殖能力
　　 3.3.1取BALB/c小鼠脾臟中的T細胞作為反應細胞，并取部分細胞

7、做分選前流式檢驗。
　　 3.3.2取C57/B6小鼠骨髓中的imDC作為刺激細胞，方法同前。
　　 3.3.3用免疫磁珠法分離并純化小鼠脾臟T細胞并用流式細胞技術檢測純化后的細胞純度。
　　 3.3.4imDC與T細胞的單向混合淋巴反應(one-waymixedlymphocytereaction，MLR):設定imDC∶T細胞比例為1∶5、1∶10、1∶20、1∶40，在96孔板中接種細胞并連續(xù)培養(yǎng)72小時，

8、于培養(yǎng)結束前4小時加入CCK-8，在加入CCK-8后的第2、3、4小時分別使用酶聯(lián)檢測儀檢測一次并記錄吸光度值。
　　 結果:
　　 1未成熟DC生長情況
　　 小鼠骨髓源細胞經(jīng)rmGM-CSF、rmIL-4誘導培養(yǎng)48小時后可見大部分細胞貼壁生長，細胞形態(tài)大小不等。于培養(yǎng)72小時后懸浮細胞較前增多，并出現(xiàn)幾個細胞聚集成團的現(xiàn)象。第5天時懸浮細胞的體積變大數(shù)量明顯增多，細胞的集落現(xiàn)象也比以前更明顯，細胞表面無典型

9、樹突樣突起，符合imDC形態(tài)。經(jīng)計數(shù)后平均每只小鼠可獲得2.2×106個imDC。
　　 2未成熟DC的電鏡下形態(tài)
　　 2.1掃描電鏡下觀察
　　 掃描電鏡下imDC呈類圓形，細胞外部結構完整，表面皺著較多似云霧狀，有少量的突起，但突起的長度短，較纖細，符合典型的imDC的形態(tài)。
　　 2.2透射電鏡下觀察
　　 imDC細胞形態(tài)規(guī)則，表面突起少，細胞微絨毛短小，細胞核偏向一側且不規(guī)則，可以看到

10、吞飲泡及較多的溶酶體。線粒體、核糖體、內質網(wǎng)數(shù)量中等。
　　 3流式細胞儀檢測imDC表面分子
　　 小鼠骨髓源未成熟樹突狀細胞高表達CD11c，純度在90％以上。細胞表面分子CD80（25.03％±2.77％）、CD86（19.93％±4.31％）、MHC-Ⅱ（23.93％±4.17％），均呈低表達，符合imDC表面標志物的特征。
　　 4imDC對同種異基因T細胞的刺激增殖能力
　　 經(jīng)免疫磁珠分選后

11、的BALB/c小鼠脾臟T細胞，F(xiàn)CM檢測其純度大于90％。不同比例與各小時組的imDC與T細胞MLR刺激指數(shù)均說明imDC有刺激同種異基因T細胞增殖的能力(SI＞1)，但各組刺激能力均很低。在加入CCK-8后的第2小時和第3小時分別檢測各相鄰imDC∶T細胞比例的刺激指數(shù)，結果均無統(tǒng)計學差異(P＞0.05);第4小時刺激指數(shù)與imDC所占比例呈正比，相鄰各組間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　 結論:
　　 1.本

12、實驗利用rmGM-CSF、rmIL-4體外誘導培養(yǎng)小鼠骨髓源imDC，并利用免疫磁珠分離提純的方法提高了imDC的純度，此方法培養(yǎng)出來的imDC具有典型的未成熟樹突狀細胞的形態(tài)，純度較高。
　　 2.從細胞形態(tài)、相對特異的表面分子的表達情況、對同種異基因T淋巴細胞的刺激增殖能力三方面證明體外培養(yǎng)所得細胞為未成熟的DC。在進行imDC與同種異型T細胞的單向混合淋巴反應時，用CCK-8法代替了傳統(tǒng)的MTT法，使得實驗結果更加穩(wěn)定、可