1、癲癇是一種常見的神經系統(tǒng)疾病，可以反復發(fā)作，有很高的發(fā)病率和致死率。在世界范圍內，有1％的人口受到癲癇的困擾，我國也有近1000萬癲癇患者，其中20%的患者會進展為難治性癲癇。癲癇長期反復發(fā)作可以引起認知功能障礙，嚴重影響患者的生活，給家庭和社會造成很大負擔。目前，臨床上應用抗癲癇藥物（Antiepileptic drugs，AEDs）來控制癲癇發(fā)作，但是AEDs藥物對三分之一的患者無效，甚至還會引起注意力下降、認知功能障礙等副作用。因

2、此，急需尋找一種既能控制癲癇反復發(fā)作，又能改善患者認知功能障礙的藥物。
　　海人藻酸（Kainic acid，KA)是一種谷氨酸的同系物，可以激活谷氨酸受體，引起神經元損傷。高劑量的KA單次給藥可以誘導實驗動物的癲癇持續(xù)狀態(tài)（Status epileptics，SE）發(fā)作，而SE會誘發(fā)自發(fā)性反復癲癇發(fā)作（Spontaneous recurrent seizures，SRS），這一過程類似于人類癲癇的發(fā)病過程，因此，該模型作為經典的

3、癲癇在體動物模型被廣泛應用于癲癇的研究。在海馬神經元中，無 Mg2+細胞外液可以誘導神經元穩(wěn)定持久放電，而神經元反復異常的放電可以造成細胞結構改變，引起突觸重構，最終形成異常的神經元網絡，該細胞模型模擬了人類癲癇發(fā)作時神經元異常放電的過程，是比較成熟的癲癇離體模型。
　　癲癇的發(fā)病機制至今尚未完全闡明，但一些重要的發(fā)病環(huán)節(jié)已為人類所知。目前，有幾種學說受到研究者們的關注，包括離子通道、谷氨酸誘導的興奮性神經毒、神經元網絡、細胞凋亡

4、和氧化應激等。氧化應激可以引起活性氧（Reactive oxygen species，ROS）產生過多，造成機體內源性的自由基和抗氧化酶失衡，引起細胞損傷。過多的ROS可以氧化DNA，調節(jié)細胞凋亡相關基因的異常表達，誘發(fā)神經元凋亡導致癲癇發(fā)作。因此，抗氧化劑在治療癲癇方面有重要作用。
　　紅景天是生長于高海拔地區(qū)的植物，在我國主要分布于西藏。紅景天苷（Salidroside，SDS）是從紅景天的根莖中提取的主要活性成分。SDS有多

5、種生物學活性，包括耐受缺氧、抗衰老、抑制腫瘤生長、消除炎癥、緩解疲勞以及心血管保護效應。近些年發(fā)現，SDS可以迅速通過血腦屏障（Blood brain barrier，BBB），對腦缺血、血管性癡呆、阿爾茲海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）有治療作用。此外，SDS還可以改善低氧引起的大鼠學習記憶功能損傷，減輕腦缺血、AD、衰老誘發(fā)的認知功能障礙。然而，SDS在癲癇中的作用尚未見相關報道。因此，本研究利用KA建立的小鼠

6、SE模型，從在體水平觀察了SDS對癲癇引起腦損傷的保護效應；利用無Mg2+細胞外液誘導的癲癇細胞模型，從離體水平探討了SDS發(fā)揮保護作用可能的分子機制。本研究由以下三部分組成。
　　第一部分紅景天苷對海人藻酸誘導的小鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)的保護作用
　　目的：建立KA誘導的小鼠SE模型，觀察SDS預處理對癲癇發(fā)作、腦電圖以及氧化應激損傷的作用。
　　方法：將雄性8-10周的C57BL/6小鼠隨機分為6組，對照組35只，其余各組

7、56只。對照組（Con）：腹腔給予0.9%無菌生理鹽水；KA組：KA溶于0.9%無菌生理鹽水，腹腔給予30 mg/kg的KA；SDS25 mg/kg+KA組：SDS溶于0.9%無菌生理鹽水，在注射KA前1 h給予25 mg/kg SDS；SDS50 mg/kg+KA：在注射KA前1 h給予50 mg/kg SDS；Vehicle+KA組：在注射KA前1 h給予0.9%無菌生理鹽水；50 mg/kg SDS組：在0.9%無菌生理鹽水注射前

8、1 h給予50 mg/kg SDS。在注射KA后2 h，觀察各組小鼠SE潛伏期、SE發(fā)生率以及腦電圖改變，依據Racine行為分級法，小鼠癲癇發(fā)作達到4級，持續(xù)時間至少30 min認為是達到SE。此外，在注射KA后15 min、45 min、3 h、6 h、12 h、24 h和48 h分別取小鼠海馬組織檢測丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量、超氧化物歧化酶（Super oxide dismutase，SOD）活性、還原

9、型谷胱甘肽（Reduced glutathione，GSH）含量。
　　結果：1在注射KA后2 h，有90%的小鼠存活，有80%的小鼠成功誘發(fā)SE。與KA組小鼠相比，SDS預處理可以延長SE發(fā)作的潛伏期（P<0.05），減少SE的發(fā)病率（P<0.05），增加小鼠的存活率，并且高濃度的SDS（50 mg/kg）比低濃度的SDS（25 mg/kg）有更明顯的保護效應（P<0.05）。Con組和SDS組小鼠均無癲癇發(fā)作，Vehicle+

10、 KA組和KA組相比，小鼠SE發(fā)作程度和潛伏期無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。2 MDA含量：與Con組相比，小鼠海馬組織MDA含量在注射KA后15 min開始增加，在45 min達到峰值，之后隨著時間推移，MDA含量有所下降，但仍高于相同時間點的 Con組（P<0.05）；SDS預處理可以明顯減少KA組小鼠海馬中MDA含量（P<0.05），并且SDS50 mg/kg組中MDA含量低于SDS25 mg/kg組（P<0.05）；與KA組相比

11、，Vehicle+KA組小鼠海馬組織中MDA含量無明顯改變（P>0.05）。3 SOD活性：給予KA后15 min，小鼠海馬組織的SOD活性開始下降，在45 min時達到最低值（P<0.05），之后有所增加，但仍低于相同時間點Con組小鼠的SOD活性（P<0.05）。與KA組相比，SDS預處理可以增加SOD活性（P<0.05），并且50 mg/kg濃度的SDS組使其增加更明顯（P<0.05）；與KA組相比，Vehicle+KA組小鼠海馬

12、組織中SOD活性無明顯變化（P>0.05）。4 GSH含量：不同實驗組中小鼠海馬組織GSH的改變趨勢與SOD相似， KA可以減少GSH含量，并且在45 min時減少最明顯（P<0.05），而SDS預處理可以增加GSH含量（P<0.05），并且50 mg/kg濃度的SDS使其增加更明顯（P<0.05）；Vehicle+KA組小鼠海馬組織中GSH的含量與KA組相比則無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。
　　第二部分紅景天苷對海人藻酸致癇小鼠

13、認知功能障礙的保護作用
　　目的：利用KA建立小鼠SE模型，觀察SDS對SRS發(fā)作、認知功能障礙和海馬神經元損傷的保護作用。
　　方法：本研究中共56只小鼠，其中10只小鼠作為對照組（Con）每天腹腔注射0.9%無菌生理鹽水，剩余46只小鼠腹腔給予30 mg/kg的KA誘導SE發(fā)作。依據Racine行為分級法，小鼠癲癇發(fā)作達到4級，持續(xù)時間至少30 min認為是達到SE，成功誘導的SE小鼠納入后續(xù)實驗。46只小鼠在注射KA后

14、2 h，41只存活，其中36只小鼠達到SE發(fā)作，將其隨機分為4組，每組9只。KA組：KA溶于0.9%無菌生理鹽水，腹腔給予30 mg/kg的KA；KA+SDS5 mg/kg組：SDS溶于0.9%無菌生理鹽水，在注射 KA后第二天開始每天腹腔給予5 mg/kg SDS，連續(xù)給藥14天；KA+SDS10 mg/kg組：從注射KA后第二天開始每天腹腔給予10 mg/kg SDS，連續(xù)給藥14天；KA+Vehicle組：從注射KA后第二天開始每

15、天腹腔給予0.9%生理鹽水，連續(xù)給藥14天。同時，用V-EEG連續(xù)記錄小鼠SRS發(fā)作情況。14天后用Morris水迷宮檢測小鼠的空間學習記憶能力；用Nissl染色觀察海馬CA1、CA3區(qū)存活神經元的形態(tài)和數目。
　　結果：1 Con組小鼠無癲癇發(fā)作；46只小鼠注射KA后，存活率為89.13%，SE發(fā)生率為78.26%。V-EEG結果顯示，與KA組相比，KA+SDS5 mg/kg組和KA+SDS10 mg/kg組中SRS每次發(fā)作持續(xù)

16、時間明顯縮短（P<0.05），并且高濃度SDS組中SRS發(fā)作時間更短（P<0.05）。KA+SDS5 mg/kg組和KA+SDS10 mg/kg組SRS發(fā)作嚴重程度、發(fā)作頻率均較KA組明顯降低（P<0.05）。KA+Vehicle組和KA組相比，SRS發(fā)作持續(xù)時間、嚴重程度和頻率均無顯著差異（P>0.05）。2 Morris水迷宮：在定位航行實驗中，隨著訓練時間增加，各組小鼠的逃逸潛伏期均縮短。從訓練第二天開始，不同實驗組小鼠的逃逸潛伏

17、期出現差異：與Con組相比， KA組小鼠逃逸潛伏期明顯延長（P<0.05）；KA+SDS5 mg/kg組和KA+SDS10 mg/kg組小鼠逃逸潛伏期較KA組明顯縮短（P<0.05）。空間探索實驗中，小鼠穿越平臺次數有顯著差異：與Con組相比，KA組小鼠穿越平臺的次數減少（P<0.05）；SDS治療組較KA組次數增多（P<0.05），并且KA+SDS10 mg/kg組多于KA+SDS5 mg/kg組（P<0.05）。KA組小鼠在目標象限

18、逗留的時間比Con組明顯縮短（P<0.05），KA+SDS5 mg/kg、KA+SDS10 mg/kg組小鼠在目標象限逗留的時間較KA組明顯延長（P<0.05）。KA+Vehicle組與KA組相比，小鼠的逃逸潛伏期、穿越平臺次數和在目標象限逗留的時間均無差異（P>0.05）?？梢娖脚_實驗中，不同實驗組小鼠的游泳速度、逃逸潛伏期均無顯著差別。3 Nissl染色：在Con組中，小鼠海馬CA1、CA3區(qū)神經元無明顯丟失、結構完整、胞漿內Nis

19、sl小體豐富；在KA組中，神經元出現明顯丟失、細胞核固縮，Nissl小體數量較Con組減少；KA+SDS5 mg/kg和KA+SDS10 mg/kg組神經元結構相對完整，Nissl小體數量較KA組增加。KA組小鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)的神經元存活數量均較Con組明顯減少（P<0.05）；與KA組相比，KA+SDS5 mg/kg組和KA+SDS10 mg/kg組神經元數量顯著增加（P<0.05），并且KA+SDS10 mg/kg組CA1、

20、CA3神經元數量均高于KA+SDS5 mg/kg組（P<0.05）；KA+Vehicle組海馬神經元存活數量與KA組相比無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。
　　第三部分紅景天苷在癲癇細胞模型中的保護作用及其分子機制
　　目的：應用無Mg2+細胞外液孵育小鼠海馬神經元建立細胞癲癇模型，觀察SDS對癲癇細胞損傷的影響及其可能的作用機制
　　方法：利用出生24 h內的小鼠分離出海馬神經元，接種到培養(yǎng)基中，培養(yǎng)到第7天，將細胞隨機

21、分為8組：正常對照組（Con）：含有1 mmol/LMg2+的細胞外液，作用神經元3 h后，更換為正常培養(yǎng)基；細胞模型組（Model）：不含Mg2+的細胞外液，作用3 h后，更換為正常培養(yǎng)基；SDS30μmol/L組：不含Mg2+的細胞外液，作用3 h后，加入含有SDS濃度為30μmol/L的培養(yǎng)基作用2 h，更換為正常培養(yǎng)基；SDS60μmol/L組：不含Mg2+的細胞外液，作用3 h后，加入60μmol/LSDS作用2 h后，更換為

22、正常培養(yǎng)基；SDS120μmol/L組：不含Mg2+的細胞外液孵育3 h后，加入120μmol/L SDS作用2 h，更換為正常培養(yǎng)基；Compound C組：不含Mg2+的細胞外液孵育3 h后，加入120μmol/LSDS作用2 h，再加入50μmol/L Compound C作用1 h，更換為正常培養(yǎng)基；Sirtinol組：不含Mg2+的細胞外液孵育3 h后，加入120μmol/LSDS作用2 h，再加入100μmol/L Siri

23、nol作用1 h，更換為正常培養(yǎng)基；Vehicle組：不含Mg2+的細胞外液孵育3 h后，加入和120μmol/L SDS相同體積的0.9%無菌生理鹽水作用2 h，更換為正常培養(yǎng)基。在各種藥物作用結束后24 h，采用CCK-8檢測細胞活力，LDH檢測細胞損傷程度，Calcein-AM/PI進行活細胞計數，流式細胞儀檢測細胞凋亡率，Real-Time PCR檢測AMPK、SIRT1的mRNA水平，Western blot檢測AMPK、SI

24、RT1的蛋白表達，SIRT1去乙?；富钚苑治鰴z測SIRT1去乙?；富钚?。
　　結果：1 CCK-8檢測：與Con組相比，癲癇細胞活力明顯下降（P<0.05）；建立癲癇細胞模型后，給予30μmol/L、60μmol/L、120μmol/L三個劑量的SDS，60μmol/LSDS組和120μmol/LSDS組細胞活力較癲癇細胞組增加，并且120μmol/LSDS組增加更明顯（P<0.05）；Vehicle組和癲癇細胞組相比細胞活力

25、無明顯改變（P>0.05）。2 LDH檢測：癲癇細胞LDH釋放量較Con組明顯增加（P<0.05），SDS可以抑制LDH的釋放，并且呈現劑量依賴性，120μmol/L濃度的SDS對LDH的釋放有更明顯的抑制作用（P<0.05）；與癲癇細胞組相比，Vehicle組細胞LDH活性無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。3 Calcein-AM/PI雙染：癲癇模型組細胞存活率較Con組明顯減少（P<0.05）；與癲癇模型組相比，SDS使細胞存活率顯著增

26、加（P<0.05）；Vehicle組和模型組相比，細胞存活率無明顯差異（P>0.05）。4細胞凋亡檢測：與Con組相比，癲癇細胞組細胞凋亡率明顯增加（P<0.05），SDS可以減少癲癇組細胞的凋亡率（P<0.05）；Compound C是AMPK（AMP-activated protein kinase，AMPK）抑制劑，Sirtinol為SIRT1（Silent information regulator1，SIRT1）酶活性抑制劑，

27、Compound C和Sirtinol可以抑制SDS對癲癇細胞凋亡的影響；Vehicle組和模型組相比，細胞凋亡率無統(tǒng)計學差異（ P>0.05）。5 Real-Time PCR：與Con組相比，癲癇組細胞中AMPK的mRNA水平下調（P<0.05）；SDS組與癲癇細胞組相比，AMPK的mRNA水平上調（P<0.05）；Vehicle組和模型組AMPK的mRNA水平無差異。SIRT1的mRNA水平在各組間無明顯改變。6 Western b

28、lot：與Con組相比，癲癇模型組細胞AMPK的蛋白表達明顯減少（P<0.05）；SDS可以使模型組AMPK的表達增加（P<0.05）；Vehicle和模型組相比，AMPK的蛋白表達無明顯差異（P>0.05）。SIRT1的蛋白表達在各組間無明顯改變。7 SIRT1去乙?；富钚裕喊d癇細胞組SIRT1去乙?；富钚暂^Con組降低（P<0.05）；與模型組相比，SDS組SIRT1活性增加（P<0.05）；Compound C組SIRT1酶活

29、性較SDS組明顯降低（P<0.05）；Vehicle組與模型組相比，SIRT1酶活性無明顯差異（P>0.05）。
　　結論：
　　1在KA誘導的小鼠SE模型中，SDS預處理可能通過改善氧化應激損傷而起到抑制SE發(fā)作的作用，并且在注射KA后45 min有最顯著作用。
　　2在KA誘導的小鼠SE模型中，SRS引起小鼠認知功能障礙和海馬CA1、CA3區(qū)神經元損傷；SDS后處理可以抑制SRS發(fā)作，并且可能通過減輕神經元損傷而改