1、本研究分析比較125例腫瘤發(fā)展不同階段結(jié)腸腺癌的臨床手術標本中S100P的表達差異，結(jié)合臨床數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。并利用S100P敲低穩(wěn)轉(zhuǎn)結(jié)腸癌細胞株分析S100P在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中所發(fā)揮的作用及其分子機制。
　　1、免疫組化檢測人結(jié)腸腺癌手術標本S100P表達情況
　　腺癌是消化道腫瘤中最為常見多發(fā)的病理類型。為了更好探尋S100P表達量與結(jié)直腸進展及預后的關系，我們利用免疫組化技術對125例不同臨床分期的結(jié)腸腺癌手術標

2、本及其配對手術切緣正常結(jié)腸組織進行分析。發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中S100P表達量顯著高于正常組織。利用統(tǒng)計學檢驗分析腫瘤組織中S100P表達量與臨床數(shù)據(jù)的相關性后，我們發(fā)現(xiàn)S100P的表達高低與患者術前血中CEA(x2=9.704，P=0.002)、CA19-9(x2=5.051，P=0.025)，腫瘤大小(x2=4.098，P=0.043)，N分期(x2=1.033，P=0.309)，M分期(x2=36.863，P＜0.001)，TNM分期(x

3、2=13.528，P＜0.001)存在相關性。在收集患者術后隨訪信息后，對S100P表達情況與患者生存時間進行生存分析后，我們發(fā)現(xiàn)S100P高表達的患者預后顯著低于S100P低表達的患者(x2=30.080，P＜0.001)。通過建立多因素COX風險預測模型，對S100P表達量與不同臨床數(shù)據(jù)進行比對分析后，結(jié)果顯示S100P（hazards ratio，HR=2.697，P＜0.001）、TNM分期(HR=3.678，P＜0.001)可

4、被視為患者預后的獨立預測因子。S100P在腫瘤中的高表達預示著腫瘤較高的轉(zhuǎn)移能力以及不良預后。
　　為了進一步驗證S100P基因在結(jié)腸癌組織中的表達情況，我們利用Q-PCR和Western blot技術對臨床結(jié)腸癌手術標本中S100P的表達量進行了檢測，結(jié)果顯示，在結(jié)腸癌組織中S100P基因的mRNA表達量約為正常組織中的3倍之多(t=7.704,P＜0.001)，結(jié)腸癌組織中S100P蛋白表達量亦是顯著高于正常結(jié)直腸組織(t=4

5、.739，P=0.018)。
　　2、S100P在結(jié)腸癌中所發(fā)揮的作用
　　為探尋S100P在結(jié)腸癌中的作用機制，選取合適的體外研究對象，我們對6種不同結(jié)腸癌細胞系:LS174T、SW480、HCT116、SW620、LOVO、DLD-1的S100P基因及蛋白表達量進行了檢測，結(jié)果顯示LS174T、HCT116、DLD-1相對于SW480、SW620、LOVO為S100P高表達細胞株。結(jié)合細胞狀態(tài)及其生長情況，最終我們選取了

6、S100P高表達的LS174T、HCT116細胞株作為我們的研究對象。
　　本研究利用siRNA干擾技術，設計針對S100PmRNA不同的siRNA，通過Q-PCR和Western blot檢測，篩選S100P干擾效率最高的siRNA，并根據(jù)其設計表達S100P-siRNA及綠色熒光(GFP)的慢病毒。利用表達S100P-siRNA的慢病毒轉(zhuǎn)入結(jié)腸癌細胞株LS174T、HCT116，構(gòu)建S100P敲低的穩(wěn)轉(zhuǎn)結(jié)腸癌細胞株LS174T

7、-S100P-KD、HCT116-S100P-KD。利用S100P敲低的穩(wěn)轉(zhuǎn)結(jié)腸癌細胞株，在體外對細胞的侵襲性、遷移性進行了檢測。通過對裸鼠的皮下成瘤及腹腔內(nèi)注射，構(gòu)建動物腫瘤模型及腹腔內(nèi)播散模型。觀察S100P表達在體內(nèi)對結(jié)腸癌細胞成瘤性及轉(zhuǎn)移性的影響。
　　3、S100P促進結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關分子機制的初步探討
　　研究表明，S100P可外分泌至細胞間質(zhì)，再與細胞膜表面蛋白RAGE結(jié)合，繼而激活下游MAPK/ERK信號通路，

8、使得Erk1/2磷酸化，從而影響細胞的生物學功能。另有報道證實，MAPK/ERK信號通路與腫瘤細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT)存在密切聯(lián)系。而EMT是腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移過程中的重要機制之一，也是當今腫瘤分子機制研究的熱門。在研究過程中，S100P與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力密切相關。
　　利用構(gòu)建的S100P敲低的穩(wěn)轉(zhuǎn)結(jié)腸癌細胞株LS174T-S100P-KD、HCT116-S100P-KD，通過Western blot檢測S100P敲低的穩(wěn)轉(zhuǎn)

9、結(jié)腸癌細胞株及陰性對照細胞株中S100P、RAGE、Erk1/2、p-Erk1/2、上皮細胞標記物E-cadherin、間質(zhì)細胞標記物N-cadherin、Vimentin、Snail的表達差異。在敲低S100P表達量后，相比未敲低S100P的陰性對照組，細胞株中RAGE及磷酸化Erk1/2的表達量隨之下降，腫瘤細胞株的上皮細胞標記物E-cadherin表達量也出現(xiàn)下降，而間質(zhì)細胞標記物N-cadherin、Vimentin、Snail

10、的表達量則出現(xiàn)了上升。初步證實了，S100P激活RAGE/ERK信號通路，促進了結(jié)腸癌細胞的EMT過程。
　　4、篩選及驗證S100P上游調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子
　　基因的表達受到體內(nèi)多種方式的調(diào)控，其中基因表達調(diào)控主要發(fā)生于轉(zhuǎn)錄過程中，調(diào)控過程圍繞著轉(zhuǎn)錄過程，如轉(zhuǎn)錄前調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。真核生物基因表達轉(zhuǎn)錄需要多種蛋白因子協(xié)助，其中轉(zhuǎn)錄因子(transcriptionfactor，TF)是一群能與DNA特定序列特異性結(jié)合，

11、從而促進或是抑制目的基因表達的蛋白質(zhì)分子，是轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的關鍵因子。
　　SOX(sex determining region Y box)家族是具有HMG盒的一類與性腺發(fā)育有關的核轉(zhuǎn)錄因子，包括A～J10個亞家族。研究發(fā)現(xiàn)，SOX家族與癌癥發(fā)生有密切聯(lián)系，包括黑色素瘤、胃癌、髓母細胞瘤、卵巢癌、胰腺癌等。SOX9最早是從一種性別反轉(zhuǎn)畸形的遺傳性疾病患者中克隆得到。近來，SOX9與腫瘤的關系也開始受到關注。
　　為驗證SOX9

12、為S100P的轉(zhuǎn)錄因子，我們首先檢測SOX9與S100P在相同結(jié)腸癌組織及細胞系中的表達情況。實驗結(jié)果證明，SOX9與S100P在結(jié)腸癌組織中均為表達升高，在高表達S100P的結(jié)腸癌細胞株中SOX9也相應的高表達，兩者存在一定相關性。接著我們利用凝膠電泳遷移實驗(EMSA)、定量染色質(zhì)免疫共沉淀(Q-ChIP)技術(HCT116:t=3.871，P=0.018; LS174T: t=2.889，P=0.016)、雙熒光素酶報告檢測系統(tǒng)檢

13、測LS174T、HCT116細胞株中SOX9與S100P基因的特異性結(jié)合情況。我們利用siRNA技術特異性干擾LS174T、HCT116細胞株SOX9表達后，觀察S100P基因表達的變化情況。
　　5、SOX9與S100P在結(jié)腸癌中表達情況的相關性分析及其在腫瘤進展中所起的作用
　　SOX9作為S100P轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控S100P轉(zhuǎn)錄表達，SOX9在結(jié)腸癌中的表達情況應影響S100P的表達。為了驗證這一理論設想，我們利用組織芯片

14、免疫組化技術分析90例人結(jié)腸腺癌手術標本中SOX9及S100P的表達情況，并利用統(tǒng)計學方法進行線性回歸分析。結(jié)果顯示在結(jié)腸癌手術標本中，SOX9與S100P的表達量存在線性回歸(R2=0.782，F(xiàn)=315.459，P＜0.001)，SOX9高表達的病例中存在S100P高表達的現(xiàn)象，兩者存在線性關系。此外，高表達SOX9及高表達S100P的病例預后顯著差于低表達組。
　　我們還構(gòu)建了SOX9干擾細胞株、SOX9過表達細胞株、SOX

15、9過表達及S100P干擾細胞株以及各自的陰性對照。通過對SOX9不同表達量細胞株進行Westernblot檢測，我們發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌細胞中高表達的SOX9通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控S100P，導致S100P表達量的升高，過表達的S100P進而激活MAPK/ERK信號通路，促進腫瘤EMT的過程，從而影響腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移能力。在過表達SOX9的同時，若敲低S100P的表達，則可逆轉(zhuǎn)這個過程，MAPK/ERK信號通路及EMT過程仍處于抑制狀態(tài)，腫瘤細胞的侵襲(t

16、=6.309，P=0.001)和轉(zhuǎn)移（t=4.769，P=0.003）能力也較SOX9過表達組大為減弱。裸鼠動物模型進一步證實了體外細胞實驗結(jié)果。
　　結(jié)論:
　　1、S100P在結(jié)腸癌組織中相比正常結(jié)直腸組織高表達。在結(jié)腸腺癌中，S100P的表達量與患者血液中CEA、CA19-9的水平、瘤體大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及TNM臨床分期相關。S100P表達量、遠處轉(zhuǎn)移情況可被視為患者生存預后的獨立預測因子。S100P高表達預示

17、著腫瘤較強的轉(zhuǎn)移能力及不良預后。
　　2、S100P促進結(jié)腸癌細胞株的侵襲、轉(zhuǎn)移及成瘤能力。
　　3、S100P通過激活RAGE/ERK信號通路，繼而促進結(jié)腸癌的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變過程，從而影響腫瘤細胞的生物學功能。
　　4、SOX9是S100P基因的轉(zhuǎn)錄因子，在結(jié)腸癌組織中高表達，是導致S100P結(jié)腸癌中高表達的原因之一。通過干擾SOX9表達，可以影響S100P的表達，SOX9對S100P基因的表達具有調(diào)控作用。