1、背景和立題依據(jù)：
　　心肌肥厚是導致心力衰竭、心律失常和猝死主要原因之一。本課題針對心肌肥厚的產(chǎn)生機制:抵抗素/脂聯(lián)素/AMPK這一通路對心肌肥厚的影響提出。本課題對尋找新的治療心肌肥厚及心衰的靶點有重要意義。實驗由體內(nèi)、體外實驗完成，是在前人研究抵抗素、脂聯(lián)素與心肌肥厚相關，激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)可抑制心肌肥厚基礎上進一步深入探討，通過注射載有抵抗素基因重組腺病毒注射液造模，并觀察抵抗素對其血壓收縮壓(SBP)和脂聯(lián)

2、素(AN)及其下游蛋白酶AMPK信號轉(zhuǎn)導子的影響。闡明抵抗素/脂聯(lián)素/AMPK在心肌肥厚形成中的重要作用，為心肌肥厚的治療提供新的靶點。
　　目的：
　　探討抵抗素對自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneous hypertensive rat，SHR)肥厚心肌腺苷酸活化蛋白激酶信號轉(zhuǎn)導分子改變的影響。注射載有抵抗素基因重組腺病毒注射液大鼠造模，并觀察抵抗素對其血壓收縮壓(SBP)和脂聯(lián)素(AN)信號轉(zhuǎn)導子的影響。
　　材

3、料與方法：
　　1.實驗藥品及主要試劑
　　大鼠脂聯(lián)素ELISA檢測試劑盒，美國ADL公司。載有抵抗素基因重組腺病毒注射液1×1010PFU，3ml，上海吉凱基因化學技術有限公司?？沽姿峄疉MPK抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，非磷酸化AMPK抗體購自美國Santa Cruz公司，Trizo1試劑購自美國Invitrogen公司，O ligo-dT、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑及Ta

4、q酶購自美國Promega公司，其他試劑均為分析純產(chǎn)品。
　　2.方法
　　2.1 實驗動物
　　8周齡Wistar大鼠及SHR大鼠，雄性，體重180-200 g，分別購自中山大學實驗動物中心和北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，合格證號分別為SCXK(粵)2013-0001和SCXK(京)2013-0002。以8周齡Wistar大鼠作為正常對照，將同周齡SHR大鼠按體重隨機分為4組，即SHR組，高劑量組（載有抵抗素

5、基因重組腺病毒注射液，劑量:1×109PFU/只），中劑量組（載有抵抗素基因重組腺病毒注射液，劑量:0.5×109PFU/只），低劑量組（載有抵抗素基因重組腺病毒注射液，劑量:0.25×109PFU/只）。
　　2.2 ELISA檢測血清脂聯(lián)素水平
　　經(jīng)腹主動脈取血至離心管中，室溫靜置1h，3000 r/min離心10min后吸取血清，按試劑盒說明書測定血清脂聯(lián)素水平。
　　2.3 RT-PCR檢測心肌AdipoR1

6、的表達
　　采用Trizo1試劑盒提取心肌組織RNA，瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性，紫外分光光度法測定RNA的濃度和純度。取RNA5ug逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進行半定量PCR反應。根據(jù)序列設計相應引物，引物序列見表1。PCR的擴增條件是:94℃預變性5 min，94℃45 s-57℃45 s-72℃60 s，30個循環(huán)后72℃充分延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳，凝膠掃描系統(tǒng)（DF-23B）英國UVP公司產(chǎn)品H

7、Z-25。采用550IW圖像分析系統(tǒng)(LEICA公司)對PCR產(chǎn)物進行光密度掃描和分析，分別計算各指標的光密度比值。
　　2.4 Western blot檢測
　　心肌AMPK的蛋白表達50 mg心肌組織研磨后放入20倍體積的裂解緩沖液(50mmol/L Tris-HCl，pH7.4,150mmol/LNacl,40mmol/L NaF,5mmol/LEDTA，5mmol/L EGTA，2.175mmol/L正釩酸鈉，1％

8、TritonⅩ-100，0.1％脫氧膽酸鈉，0.1％ SDS，0.1％抑蛋白酶肽，1 mmol/L PMSF)中1000×g離心10min，收集上清，Lowry法測定蛋白濃度。配制SDS聚丙烯酰胺凝膠(4％濃縮膠，9％分離膠)，蛋白上樣量為50ug，電泳(濃縮膠80V，分離膠150V)結(jié)束后，取出凝膠，將蛋白電轉(zhuǎn)(200mA恒流冰浴轉(zhuǎn)2h)至聚偏二氟乙烯膜(po lyvinylidene difuo ride，PVDF)上。PVDF膜用

9、5％脫脂奶粉室溫封閉2h，含0.05％ Tween20的PBS(PBST)沖洗后，用抗磷酸化AMPK（1∶1000稀釋）進行孵育，4℃過夜。經(jīng)PBST沖洗后加入辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2h。PB ST沖洗，用化學發(fā)光劑發(fā)光，在暗盒中膠片上曝光1～5 m in，顯影、定影后觀察結(jié)果。PVDF膜經(jīng)洗膜液洗脫30min后加抗AM PK(1∶1000稀釋)孵育，其余操作同上。采用550IW圖像分析系統(tǒng)對條帶進行光密度掃描和分析。

10、　　2.5 統(tǒng)計學方法
　　實驗結(jié)果計量資料以均數(shù)±標準差表示，進行方差齊性檢驗，方差齊，多組組間比較采用方差分析，方差不齊采用秩和檢驗;計數(shù)資料采用計數(shù)（百分率）表達，率的比較采用x2檢驗。全部資料用采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果：
　　與Wistar大鼠比較，SHR大鼠血壓收縮壓、心肌肥大指數(shù)均顯著升高(P＜0.05)，血清脂聯(lián)素(AN)、心肌組織AdipoR1、AMPK含量降低(P＜0.05