1、背景：
　　胃癌是全球范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，其死亡率居惡性腫瘤第二位。常規(guī)治療后復發(fā)和轉(zhuǎn)移是胃癌患者死亡的重要原因。因此如何遏制胃癌復發(fā)和轉(zhuǎn)移是目前研究的重點，而近年來腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSC)理論的提出為胃癌治療提供了新的思路。CSC理論認為，只有一小部分腫瘤細胞具有自我更新和無限增殖能力，并由此產(chǎn)生大量相對成熟的常規(guī)腫瘤細胞(regular cancer cells，RCC)，這些處于腫瘤分化

2、層級頂點的細胞亞群是腫瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源。研究人員堅信只有真正消滅CSC，才能根除腫瘤。但到目前為止，仍缺少合適的篩選CSC方法，這也極大的限制了人們對包括胃癌干細胞(gastric cancer stem cells，GCSC)在內(nèi)的CSC研究。
　　我們知道，正常祖細胞群仍具有一定程度的“干性”，同時也表達干細胞相關標記物。以此類推，腫瘤祖細胞（cancer progenitor cells，CPC）也極有可能具有這種特點。而

3、目前篩選CSC的辦法無法排除CPC的存在，因此也有研究用到了CSC/CPC來描述獲得的干性細胞群。然而CSC與CPC的生物學特性可能存在著較大差異，這種混雜的細胞群可能無法真實反映出這兩個細胞亞群的生物學特性。另一方面，CSC理論是建立在正常組織干細胞理論基礎上提出的，即腫瘤組織中應該具有類似正常組織干細胞中由干細胞到祖細胞再到成熟細胞的漸進分化過程。但是目前多數(shù)實驗僅是將腫瘤細胞群單純的分為CSC與非CSC，這不足以說明這種分化過程的

4、存在。由此可見，如果能找到合適的方法在腫瘤細胞群中分選出CSC、CPC及RCC，將對深入了解GCSC的生物學特性及完善CSC理論有著重要意義。
　　由于需要在腫瘤干性細胞群中篩選出干性程度高的CSC群與干性程度低的CPC群，因此只有選擇與細胞干性密切相關并可區(qū)分出強弱表達的標記物才具有可行性。乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase，ALDH)具有這種特性，ALDH是細胞內(nèi)具有解毒作用的酶類，且在正常干細胞(ste

5、m cells，SC)的增殖、分化過程中發(fā)揮著重要作用。ALDH作為一種功能性的SC標記物，具有在干細胞中高活性，成熟細胞中低活性或無活性的特點，其活性的高低可以反映出細胞的干性程度。而近年來，已有大量研究人員應用ALDH活性檢測方式成功富集了CSC。雖然這些獲得的“CSC”仍存在著與CPC混雜的問題，但基于ALDH這種隨著細胞“干性”遞減而表達量逐步下降的特點或許可以成為篩選腫瘤細胞中不同分化層級細胞亞群的標記物。
　　基于樹突

6、狀細胞(dendritic cells，DC)的過繼免疫治療（adoptive cellularimmunotherapy，ACI）被認為具有良好的應用前景，以DC荷載抗原誘導成熟的細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic t lymphocyte，CTL)更是具有高靶向性高殺傷性腫瘤細胞的優(yōu)勢。同時已有研究發(fā)現(xiàn)應用過繼免疫治療靶向CSC會取得更好的療效。但是在GCSC及胃癌祖細胞（gastric cancer progenitor ce

7、lls，GCPC）方面的應用未見報道。
　　目的：
　　1.利用ALDH活性評估方式分選胃癌細胞中不同分化層級亞群
　　2.探明胃癌細胞中不同分化層級亞群的生物學特性
　　3.明確靶向胃癌細胞中不同分化層級亞群的CTL抑瘤效果
　　方法：
　　1.流式細胞技術檢測胃癌細胞系MFC中ALDH活性強度:根據(jù)檢測結(jié)果，選取ALDH陽性細胞群中熒光強度最強的細胞亞群作為ALDHhigh群，選取ALDH陽性細胞

8、群中熒光強度最弱的細胞亞群作為ALDHlow群，選取ALDH陰性細胞群中的相對熒光強度最弱的細胞亞群作為ALDHneg群。
　　2.流式細胞技術檢測各亞群細胞CD44、CD133表達情況及細胞周期分析。
　　3.RT-PCR技術檢測各亞群細胞OCT-4、 SOX-2基因的表達情況。
　　4.體外成球?qū)嶒炘u估各亞群細胞自我更新能力。
　　5.小鼠皮下致瘤實驗探究各亞群細胞致瘤能力。
　　6.CCK8法檢測各亞

9、群細胞增殖及耐藥能力。
　　7.Transwell細胞侵襲實驗檢測各亞群細胞侵襲能力。
　　8.平板克隆實驗檢測各亞群細胞克隆能力。
　　9.應用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。
　　結(jié)果：
　　1.ALDH活性表達與MFC細胞干性相關
　　(1) MFC中ALDH陽性細胞群比例占5％±0.91％，我們以ALDH陽性群中熒光強度最強的1％細胞亞群作為ALDHhigh亞群，ALDH陽性群中熒光強度最

10、弱的1％細胞亞群作為ALDHlow亞群，相對無ALDH活性的1％細胞群作為ALDHneg亞群。(2)三群細胞中，CD44比例均大于90％，不適合作為MFC的干性標記物;而隨著ALDH活性的降低，CD133比例逐漸下降，分別為(44.07％±3.97％、34.33％±3.06％、1.60％±0.66％)，ALDHhigh及ALDHlow表達量明顯高于ALD Hneg(P＜0.01)，ALDHhigh比例雖高于ALDHlow，但無統(tǒng)計學差異

11、(P=0.09)。(3)干性基因OCT-4、SOX-2表達也呈現(xiàn)同樣的趨勢，其中OCT-4在ALDHhigh、ALDHlow及ALDHneg群相對表達量分別為(0.99±0.10;0.43±0.04;0.28±0.03，P＜0.05);SOX-2趨勢同OCT-4，表達量分別(1.00±0.08;0.63±0.05;0.14±0.03，P＜0.05)。(4) ALDHhigh及ALDHlow均可在無血清超低粘附條件下形成腫瘤球。相同時間內(nèi)

12、，ALDHhigh形成的腫瘤球體積明顯小于ALDHlow，而ALDHhigh球體內(nèi)ALDH陽性細胞比例明顯大于ALDHlow(70.1％±7.1％ VS30.5％±5.7％，P＜0.01);ALDHlow細胞亞群在5000/只致瘤條件下致瘤能力強于其他組，而在500/只致瘤條件下，ALDHhigh致瘤能力最強。
　　2.ALDH不同活性細胞亞群生物學特性不同
　　(1)ALDHlow細胞亞群體外增殖能力強于其他組，而ALDH

13、high亞群增殖能力最低;(2)S/G2/M期在ALDHhigh、ALDHlow及ALDHneg細胞亞群中比例分別為(40.6％±4.6％;91.1％±1.3％;60.5％±3.4％)組間均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05);(3)隨著 ALDH活性下降，各細胞亞群耐藥能力逐步下降;(4)ALDHlow細胞亞群形成的克隆數(shù)量為(166.3±14.9)明顯多于其他組(P＜0.01)，而ALDHhigh細胞亞群克隆數(shù)量多于ALDHneg細胞亞群(

14、36.1±6.3;8.0±2.6，P＜0.05)。(5)ALDHhigh組侵襲能力明顯強于其他組(51.7±9.1，P＜0.05)，而ALDHlow組侵襲細胞數(shù)量與ALDHneg組相比，差異無統(tǒng)計學意義(9.7±3.5;11.7±3.6，P=0.895)。
　　3.CTL靶向ALDH各細胞亞群具有不同的抑瘤效果
　　CTL各治療組小鼠抑瘤率由高到底分別為CTL-ALDHow、CTL-ALDHhigh、CTL-ALDHneg(

15、88.2％±6.3％,68.7％±11.3％;43.2％±29.6％);CTL-ALDHhigh、CTL-ALDHlow、CTL-ALDHeg及PBS對照組外周血CD3+T細胞比例分別為(53.4％±2.7％;52.2％±3.8％;52.3％±6.1％;44.1％±3.2％)，各治療組比例均大于PBS對照組，但CTL-ALDHneg組與PBS組相比無統(tǒng)計學意義(P=0.216)，各治療組之間無明顯差異。上述組序中外周血CD3+CD8+T

16、細胞比例均高于PBS對照組(24.4％±3.2％;26.3％±1.7％;21.9％±2.5％;11.5％±1.8％;P＜0.01)。組間無明顯差異。上述組序中脾臟血的CD3+T細胞比例分別為(20.3％±2.3％;19.06％±1.4％;19.4％±4.7％;10.2％±2.1％)，各治療組比例均大于PBS對照組(P＜0.05)，治療組間無統(tǒng)計學差異;上述組序中脾臟血的CD3+CD8+T細胞比例分別為(6.7％±2.0％;5.4％±0.

17、9％;5.8％±0.5％;1.8％±0.5％)，各治療組比例均明顯高于PBS對照組(P＜0.05)，各治療組間無統(tǒng)計學差異。
　　結(jié)論：
　　1.胃癌干性細胞群中存在著生物學特性不同的CSC與CPC，ALDH活性分選可以作為區(qū)分CSC與CPC的方法;在干性群中排除CPC是以后提高CSC研究結(jié)果可靠度的有效方式。
　　2.CPC與CSC相比，雖然自我更新能力較低，但增殖能力更高，短時間內(nèi)的危害要高于CSC。
　　3