1、兒童中多發(fā)的齲病、牙髓疾病和根尖周疾病不僅影響兒童的咀嚼和發(fā)音功能，危及牙齒及牙列的正常發(fā)育，并且影響兒童的生理和心理健康。由于兒童正處于生長發(fā)育期，牙齒根尖多未發(fā)育完全，根尖孔呈開放狀態(tài)。有別于成人的治療方案，目前對于兒童口腔疾病的治療手段著力于促進(jìn)牙齒根尖部硬組織包括牙本質(zhì)、牙骨質(zhì)、牙槽骨的正常發(fā)育，使患牙能恢復(fù)正常功能。傳統(tǒng)藥物治療對牙齒周圍組織有一定損傷性，臨床亟待更安全有效的方法促進(jìn)根尖組織再生，近年來干細(xì)胞技術(shù)和牙組織工程的

2、研究為兒童牙病治療的發(fā)展提供了新思路。
　　根尖牙乳頭干細(xì)胞(Stem Cells from the Apical Papilla,SCAP)是一類具有自我更新和多向分化潛能的成體干細(xì)胞。研究表明 SCAP是牙根發(fā)育時成牙本質(zhì)細(xì)胞的主要來源,在牙根的形成和發(fā)育中起著重要的作用,是根尖組織再生比較理想的種子細(xì)胞。但鑒于細(xì)胞來源有限、數(shù)量很少等困難，本課題利用永生化根尖牙乳頭干細(xì)胞（immortalized Stem Cells fr

3、om the Apical Papilla, iSCAP）進(jìn)行研究，細(xì)胞數(shù)量充足，生物性能良好。
　　由于干細(xì)胞可多向分化，因此尋找促進(jìn)干細(xì)胞定向成骨分化的細(xì)胞因子則一度成為骨組織再生領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)問題，其中Wnt和骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）信號通路在動物胚胎發(fā)育、器官形成、組織再生過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，尤其在成骨分化方面作用更突出，目前已分離出20余種Wnt基因和14余種

4、BMP基因。實(shí)驗(yàn)室前期比較19種表達(dá)Wnt蛋白的腺病毒，檢測發(fā)現(xiàn)Wnt3、Wnt3A激活β-catenin的轉(zhuǎn)錄活性最強(qiáng)；分析14種BMP中，BMP9在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)都表現(xiàn)出對間充質(zhì)干細(xì)胞最強(qiáng)的誘導(dǎo)成骨分化能力。但是，Wnt與BMP能否誘導(dǎo)根尖牙乳頭干細(xì)胞成骨分化、兩者之間是否存在“串話”以及其作用機(jī)制尚不明確。
　　本實(shí)驗(yàn)研究的目的是：探究（1）Wnt3A和 BMP9是否能誘導(dǎo)根尖牙乳頭干細(xì)胞成骨分化；（2）β-catenin在

5、Wnt3A和BMP9誘導(dǎo)根尖牙乳頭干細(xì)胞成骨分化中是否發(fā)揮著關(guān)鍵的作用；（3）Wnt3A和BMP9誘導(dǎo)根尖牙乳頭干細(xì)胞成骨分化中是否存在協(xié)同關(guān)系及可能的機(jī)制。
　　本研究的第一部分首先將同時載有3段沉默β-catenin基因片段的質(zhì)粒 pMPB-simBC轉(zhuǎn)染入 iSCAP細(xì)胞（iSCAP-KD）中，實(shí)時定量Real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)β-catenin基因沉默后目的基因mRNA表達(dá)明顯降低。用腺病毒W(wǎng)nt3A分別感染iSC

6、AP-Ctrl和 iSCAP-KD兩種細(xì)胞，pTOP-Luc熒光素酶報告基因檢測顯示iSCAP-KD組β-catenin轉(zhuǎn)錄活性明顯減弱；Real-time PCR顯示β-catenin沉默后，Wnt3A通路下游靶基因 c-Myc的 mRNA表達(dá)降低；細(xì)胞免疫熒光染色檢測顯示iSCAP-KD組與 iSCAP-Ctrl組相比，β-catenin核內(nèi)轉(zhuǎn)移明顯減少，細(xì)胞質(zhì)表達(dá)強(qiáng)度也減弱。可見，RNA干擾質(zhì)粒pMPB-SimBC可有效降低β-c

7、atenin在iSCAP細(xì)胞中的表達(dá)和活性。接下來，用Wnt3A分別感染iSCAP-Ctrl和 iSCAP-KD并檢測細(xì)胞的成骨分化情況。結(jié)果顯示， Wnt3A可促進(jìn) iSCAP細(xì)胞早期成骨分化指標(biāo)—堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性和表達(dá)升高，并且呈劑量依賴性，iSCAP-KD組ALP活性和表達(dá)比對照組明顯下調(diào)；但茜素紅染色顯示晚期成骨分化指標(biāo)鈣鹽沉積和Real-time PCR檢測骨橋蛋白（osteo

8、pontin,OPN）、骨鈣素（osteocalcin,OCN）在iSCAP-Ctrl和 iSCAP-KD兩組中均未見明顯表達(dá)。說明Wnt3A可促進(jìn)iSCAP細(xì)胞早期成骨分化，但對晚期成骨沒有明顯作用。
　　本研究的第二部分首先用腺病毒 BMP9感染 iSCAP-Ctrl和iSCAP-KD兩種細(xì)胞，檢測BMP9對iSCAP細(xì)胞的成骨分化作用。結(jié)果顯示，BMP9可促進(jìn)iSCAP細(xì)胞ALP活性和表達(dá)升高、OPN和OCN表達(dá)明顯、鈣鹽沉

9、積結(jié)節(jié)增多，并且呈劑量依賴性； iSCAP-KD組與iSCAP-Ctrl組相比，BMP9對其誘導(dǎo)成骨分化作用明顯減弱?？梢姡聊?catenin能抑制BMP9對iSCAP細(xì)胞的成骨分化作用。接下來通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Wnt3A和BMP9信號通路對iSCAP細(xì)胞成骨分化的協(xié)同促進(jìn)作用。結(jié)果表明，ALP活性測定顯示W(wǎng)nt3A和BMP9聯(lián)合作用均大于單獨(dú)使用Wnt3A或BMP9，且呈劑量依賴性，沉默β-catenin后兩者的協(xié)同成骨能力也

10、明顯減弱；裸鼠異位成骨實(shí)驗(yàn)顯示W(wǎng)nt3A和BMP9聯(lián)合作用生成骨小梁數(shù)量明顯增多，骨基質(zhì)連續(xù)性好，排列緊密， Masson’s Trichrome染色顯示紅染程度強(qiáng)，生成的成熟和礦化骨基質(zhì)多。最后探討了Wnt3A和BMP9信號通路協(xié)同成骨的可能作用機(jī)制。將腺病毒W(wǎng)nt3A、BMP9和β-catenin分別刺激轉(zhuǎn)染了熒光素酶報告基因p6OSE2-Luc的iSCAP-Ctrl和iSCAP-KD細(xì)胞，結(jié)果顯示三種病毒均可使iSCAP細(xì)胞中Ru

11、nx2轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，但β-catenin沉默后Runx2不能被活化。因此，本研究推測Runx2可能是Wnt3A和BMP9協(xié)同作用的交叉點(diǎn)，沉默β-catenin基因會阻斷其入核激活TCF1，從而無法激活Runx2。
　　綜上所述，Wnt3A和BMP9均可誘導(dǎo)iSCAP細(xì)胞成骨分化，兩者聯(lián)合應(yīng)用更具有協(xié)同促進(jìn)的作用，沉默β-catenin基因可明顯抑制成骨表達(dá)，Runx2活化可能成為介導(dǎo)Wnt3A和BMP9信號通路協(xié)同作用的關(guān)鍵交叉