1、干細胞在組織工程學中的運用將為牙髓/牙本質再生和生物性牙根的形成提供廣闊的運用前景。根尖牙乳頭干細胞(stem cells from the apical papilla,SCAPs)位于未發(fā)育完成的年輕恒牙的根尖部,是一種取自正在發(fā)育組織的成體間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)。SCAPs具有多向分化的潛能,在特定培養(yǎng)液誘導下可形成類牙髓/牙本質,且被認為是牙根部成牙本質細胞的來源,最終形成牙根部牙

2、本質。SCAPs與牙髓干細胞(dental pulp stem cells,DPSCs)相比,具有較強的成牙分化能力和較低的免疫原形,此特性被認為更適合運用于骨/牙體組織再生領域。
　　核轉錄因子NFIC(nuclear factor I-C)在調控牙根的發(fā)育中發(fā)揮了重要作用。敲除NFIC的小鼠,形成短小的磨牙牙根,而牙冠發(fā)育正常。鑒于NFIC是特異性調控牙根發(fā)育的信號分子,而SCAPs是牙根成牙本質細胞的來源,那么,NFIC在調

3、控SCAPs分化中的作用及其機制如何,目前尚不清楚。
　　牙齒的發(fā)育是由一系列上皮和間充質相互作用而形成,眾多的細胞因子參與了牙齒發(fā)育的調控。轉化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)超家族,包括TGF-βs,骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)和激活素類等相關蛋白,參與調節(jié)細胞增殖、分化及上皮間充質轉換和胚胎發(fā)育等。研究發(fā)現NFIC通過抑制TG

4、F-β1調控的基因表達,影響皮膚傷口的愈合;敲除NFIC后,小鼠異常的成牙本質細胞中TGF-βⅠ型受體和磷酸化的Smad2/3顯著上調,提示,NFIC可能參與TGF-β信號通路,但是兩者是在調控SCAPs分化中的作用機制尚不清楚。
　　本課題首先成功分離、培養(yǎng)和鑒定人根尖牙乳頭干細胞。隨后分別轉染所構建的慢病毒NFIC真核表達載體或沉默NFIC的siRNA。通過體內、外實驗觀察NFIC對SCAPs增殖、分化的影響。最后,研究TGF

5、-β1對SCAPs生物學特性及分化的影響,討論NFIC與TGF-β1信號通路在SCAPs分化中的相互作用。為將來SCAPs在牙髓牙本質再生和生物性牙根方面的應用提供新的思路。
　　結果如下:
　　1.人根尖牙乳頭感干細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　選取因正畸原因而拔除的年輕患者第三磨牙,分離培養(yǎng)人原代SCAPs,有限稀釋法純化獲得單克隆的細胞;免疫組織化學染色及流式細胞儀鑒定間充質干細胞標記物STRO-1等;成骨誘導、成脂

6、誘導實驗證實細胞的多向分化能力。
　　2.轉錄因子NFIC促進SCAPs分化能力
　　構建NFIC慢病毒真核表達載體plenti-NFIC后,與沉默NFIC的siRNA分別轉染SCAPs。過表達NFIC還促進SCAPs的增殖能力、ALP活性和成骨/牙分化能力。此外,NFIC還不同程度地增強礦化基因標記物ALP、OCN和Col.I的mRNA;蛋白質印跡免疫檢測技術也證實NFIC上調DSP蛋白水平。而沉默NFIC,則明顯抑制SC

7、APs礦化能力及礦化基因ALP、OCN和Col.I的表達。此外,過表達NFIC增強脂滴的形成和成脂標記物CCAAT增強結合蛋白(CCAAT/enhancer binding protein)C/EBP-β、C/EBP-δ和過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor-y,PPAR-γ)的表達。
　　體內研究進一步證實:過表達NFIC的SCAPs細胞復合膠原/煅燒牛

8、骨(calcined bovine bone,CBB)材料植入免疫缺陷型小鼠的皮下12周后,可促進形成類成牙本質細胞和牙本質樣結構。
　　3.轉錄因子NFIC參與TGF-β1信號通路對SCAPs的調控
　　不同濃度TGF-β1均抑制SCAPs增殖和體外礦化結節(jié)形成,并下調礦化基因的表達,而分別應用TGF-β1Ⅰ型受體抑制劑SB431542和Smad3的抑制劑SIS3阻斷TGF-β信號通路后,可部分逆轉TGF-β1對SCAPs

9、增殖和分化的抑制作用。TGF-β1抑制NFIC蛋白的表達,過表達NFIC減弱TGF-β1對SCAPs礦化能力的抑制作用,而沉默NFIC則增強了TGF-β1對SCAPs成牙/骨的分化能力。實驗結果顯示NFIC參與TGF-β1信號通路對SCAPs的生物學調控。
　　綜上所述,本研究通過體內/外實驗證實NFIC可以促進根尖牙乳頭干細胞的增殖和分化能力;而TGF-β1則起抑制作用;且NFIC參與了TGF-β1對根尖牙乳頭干細胞分化特性的調