1、目的：
　　本課題擬采用紫外線照射誘導(dǎo)的白內(nèi)障模型小鼠，利用實時定量PCR、Western blot、TUNEL等實驗技術(shù)手段，研究Eaf2基因敲除對紫外線照射誘導(dǎo)的小鼠晶狀體上皮細胞凋亡的影響及其可能的作用機理。
　　方法：
　　1、分別構(gòu)建Eaf2基因過表達載體和干擾載體
　　2、過表達和干擾Eaf2晶狀體上皮細胞系的建立
　　3、RT-PCR測定各組細胞mRNA的轉(zhuǎn)錄水平
　　4、Western

2、 Blot檢測各組細胞蛋白的表達情況
　　5、TUNEL測定各組細胞凋亡情況
　　6、紫外線(UV)輻射晶狀體
　　實驗所用紫外線波長為302nm，強度為200W/cm2，將紫外透射光源用錫箔紙覆蓋，只留有一個直徑5mm的小孔。紫外線照射時，不對小鼠進行麻醉，直接照射。只對每只小鼠的右眼進行照射，左眼作為對照，不進行紫外線的照射。于紫外線照射前5分鐘，對每只小鼠的右眼進行復(fù)方托吡卡胺散瞳。紫外線照射每周進行兩次，每次持

3、續(xù)100 s，共照射3周時間（總共1200 mJ/cm2）。
　　7、TUNEL測定不同樣本組織細胞凋亡
　　8、Caspase3、Caspase9活性測定及Western Blot分析
　　9、裂隙燈觀察晶狀體混濁程度變化
　　最后一次紫外線輻射后48小時后，裂隙燈檢查小鼠晶狀體混濁程度，利用晶狀體混濁分類系統(tǒng)Ⅱ(lens opacities classification systemⅡ，LOCSⅡ)對晶狀體混

4、濁程度進行分級，晶狀體皮質(zhì)完全透明為0級，少量點狀混濁為1級，點狀混濁擴大，瞳孔區(qū)出現(xiàn)少量點狀混濁為2級，車輪狀混濁，超過兩個象限為3級，車輪狀混濁擴大，瞳孔區(qū)約50％的混濁為4級，瞳孔區(qū)90％的混濁為5級
　　10、暗室野顯微鏡觀察晶狀體混濁程度變化
　　裂隙燈檢查后，斷頸處死小鼠摘取晶狀體以進行暗視野顯微鏡照相，根據(jù)所拍攝的圖像，利用Image J軟件對白內(nèi)障區(qū)域比例進行分析，白內(nèi)障區(qū)域比例(cataract area

5、ratio)=白內(nèi)障區(qū)域面積/前囊膜(anterior capsules)區(qū)域面積。
　　結(jié)果：
　　1、Eaf2 OE提高了Eaf2的表達水平，Eaf2shRNA降低了Eaf2的表達水平。
　　構(gòu)建Eaf2OE質(zhì)粒和Eaf2shRNA質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)染晶狀體上皮細胞，通過qRT-PCR和Western Blot來檢測轉(zhuǎn)染效率。qRT-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染Eaf2OE后晶狀體上皮細胞中Eaf2 mRNA的表達量顯著升高;We

6、stern Blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染Eaf2OE后Eaf2蛋白表達水平顯著升高;這兩項結(jié)果表明在晶狀體上皮細胞中轉(zhuǎn)染Eaf2OE能夠有效地增加Eaf2的表達水平。相反，qRT-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染Eaf2shRNA后晶狀體上皮細胞中Eaf2 mRNA的表達量顯著降低;Western Blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染Eaf2shRNA后Eaf2蛋白表達水平顯著降低;這兩項結(jié)果表明在晶狀體上皮細胞中轉(zhuǎn)染Eaf2shRNA能夠有效地降低Eaf2的表達水平。

7、r>　　2、TUNEL法測試各組樣本晶狀體上皮細胞凋亡的情況
　　利用TUNEL試劑盒測試了各組小鼠晶狀體組織樣本中細胞凋亡的情況。結(jié)果顯示Eaf2OE組引起晶狀體上皮細胞發(fā)生明顯的凋亡現(xiàn)象，而在Control、Vector、Eaf2shRNA、NC組的樣本中可見散在幾個凋亡細胞。在Eaf2shRNA組與NC組之間，兩者的細胞凋亡水平未見明顯差別。
　　3、在晶狀體上皮細胞中分別轉(zhuǎn)染Eaf2OE和Eaf2shRNA后對cle

8、aved-Caspase3、cleaved-Caspase9和cleaved-PARP蛋白質(zhì)的表達情況
　　通過Western Blot技術(shù)我們測定了各組中cleaved-Caspase3、cleaved-Caspase9和cleaved-PARP蛋白質(zhì)的表達量情況。轉(zhuǎn)染Eaf2OE的晶狀體上皮細胞中上述三種蛋白的表達量顯著提高;相反，轉(zhuǎn)染Eaf2shRNA的晶狀體上皮細胞中上述三種蛋白的表達量明顯降低，這表明Eaf2基因能夠促進

9、Caspase3、Caspase9和PARP的激活，從而促進凋亡。
　　4、在晶狀體上皮細胞中分別轉(zhuǎn)染Eaf2OE和Eaf2shRNA后對Bax和Bcl-2蛋白質(zhì)表達水平的比較
　　利用Western Blot技術(shù)我們檢測了Bax和Bcl-2蛋白在各組的表達差異。在轉(zhuǎn)染Eaf2OE質(zhì)粒的晶狀體上皮細胞中，Bax蛋白的表達量顯著提高，而Bcl-2蛋白的表達量明顯降低;相反，在轉(zhuǎn)染Eaf2shRNA質(zhì)粒的晶狀體上皮細胞中，bax

10、蛋白的表達量顯著降低，而Bcl-2蛋白的表達量明顯提高，這表明Eaf2基因可能通過影響凋亡相關(guān)蛋白的表達而促進凋亡。
　　5、紫外線輻射可以誘導(dǎo)晶狀體上皮細胞發(fā)生凋亡
　　利用TUNEL試劑盒測試了各組小鼠樣本晶狀體上皮細胞凋亡的情況。結(jié)果顯示紫外線輻射會引起晶狀體上皮細胞發(fā)生明顯的凋亡現(xiàn)象，同時在未接受紫外線輻射的樣本中幾乎沒有發(fā)現(xiàn)凋亡細胞。在WT-UV組與Eaf2 KO-UV組之間，前者表現(xiàn)出更加顯著的細胞凋亡水平。

11、r>　　6、Eaf2蛋白質(zhì)會提高細胞內(nèi)Caspase3和Caspase9蛋白酶活性
　　Caspase3和Caspase9是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶家族中的重要成員，它們是凋亡過程中不可逆的節(jié)點。Caspase3和Caspase9蛋白酶活性測定顯示出紫外線輻射會顯著增加這兩種蛋白水解酶的活性，并且在相同的紫外線劑量輻射下，Caspase3和Caspase9蛋白酶活性在WT-UV組顯著高于Eaf2 KO-UV組的數(shù)據(jù)。通過Ca

12、spase3和Caspase9蛋白酶活性的檢測，表明Eaf2蛋白質(zhì)的表達會加劇紫外線誘發(fā)的晶狀體上皮細胞凋亡。
　　7、Eaf2蛋白質(zhì)能夠影響凋亡相關(guān)蛋白的表達情況
　　Eaf2蛋白質(zhì)能夠增加Bax的表達，降低Bcl-2的表達。Western blot法測定各組樣本中Bax，Bcl-2這兩種蛋白質(zhì)的相對表達水平，結(jié)果:WT-UV組和Eaf2KO-UV組的Bax蛋白相對表達量均顯著提高(P＜0.05)，其中WT-UV組高于Ea

13、f2KO-UV組(P＜0.05);WT-UV組的Bcl-2蛋白相對表達量比WT-nonUV組顯著降低（P＜0.05），Eaf2 KO-UV組輕度降低(P＜0.05)。通過這兩種凋亡相關(guān)蛋白的檢測，提示Eaf2蛋白質(zhì)對紫外線誘導(dǎo)晶狀體上皮細胞的凋亡具有促進作用。
　　8、Eaf2蛋白質(zhì)能夠激活ERK信號通路
　　Western blot法測定各組樣本中ERK及p-ERK的相對表達水平，結(jié)果顯示:四組樣本中ERK蛋白表達水平相似

14、(P＞0.05); WT-UV組的p-ERK蛋白相對表達量比WT-nonUV組顯著降低(P＜0.05)，Eaf2 KO-UV組輕度降低(P＜0.05)。通過對ERK及p-ERK的檢測，提示Eaf2蛋白質(zhì)能夠激活ERK信號通路。
　　9、裂隙燈顯微鏡觀察小鼠白內(nèi)障的形成
　　裂隙燈顯微鏡觀察晶狀體混濁程度的小鼠眼球前節(jié)照相:A圖顯示W(wǎng)T-UV;B圖顯示Eaf2KO-UV;C圖顯示W(wǎng)T-nonUV;D圖顯示Eaf2KO-nonU

15、V.圖中可以觀察到A組和B組晶狀體均可見明顯晶狀體皮質(zhì)混濁，C組和D組可見少量點狀晶狀體皮質(zhì)混濁，根據(jù)晶狀體混濁分類系統(tǒng)Ⅱ(lens opacities classification systemⅡ，LOCSⅡ)對晶狀體混濁程度進行分級，A圖為4級，B圖為3級，C圖及D圖為1級。所有樣本進行秩和檢驗統(tǒng)計結(jié)果為:WT-UV組及Eaf2KO-UV組晶狀體混濁程度明顯高于WT-nonUV組及Eaf2KO-nonUV組，其中WT-UV組明顯高于

16、Eaf2KO-UV組，均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　10、暗視野顯微鏡觀察小鼠白內(nèi)障的形成
　　暗室野顯微鏡觀察晶狀體混濁面積:A圖顯示W(wǎng)T-UV;B圖顯示Eaf2KO-UV;C圖顯示W(wǎng)T-nonUV;D圖顯示Eaf2KO-nonUV.圖中可以觀察到A組和B組晶狀體可見明顯晶狀體皮質(zhì)混濁，C組和D組未見明顯晶狀體皮質(zhì)混濁，其中圖中A圖中白內(nèi)障的面積占整個前囊膜面積比例的59.2％，B圖為25.4％，C圖為0％，D圖

17、為0％。所有樣本的均值統(tǒng)計結(jié)果為:WT-UV組白內(nèi)障面積比例為57.9％±11.2％，Eaf2KO-UV組為27.8％±10.7％，WT-nonUV組為3.8％±1.7％，Eaf2KO-nonUV組為2.8％±1.4％。WT-UV組及Eaf2KO-UV組晶狀體混濁面積明顯高于WT-nonUV組及Eaf2KO-nonUV組，其中WT-UV組明顯高于Eaf2KO-UV組，均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、在

18、晶狀體上皮細胞中可有效地轉(zhuǎn)染Eaf2OE質(zhì)粒及Eaf2shRNA質(zhì)粒。
　　2、在體外實驗中Eaf2蛋白質(zhì)具有促進晶狀體上皮細胞凋亡的能力。
　　3、紫外線輻射可以誘導(dǎo)晶狀體上皮細胞發(fā)生凋亡。
　　4、Eaf2蛋白質(zhì)對紫外線誘導(dǎo)的晶狀體上皮細胞的凋亡具有促進作用。
　　5、Eaf2蛋白對晶狀體上皮細胞凋亡的促進作用可能是通過影響ERK信號通路來實現(xiàn)的。
　　6、紫外線輻射能夠?qū)е滦∈蟀變?nèi)障的形成。