1、目的:白念珠菌是引起人類真菌感染的主要致病菌，在醫(yī)院獲得性感染中居第四位，死亡率接近50％，它常寄生在人類的口腔、下呼吸道、胃腸道和泌尿生殖道中，可引起口腔泌尿生殖道等的表淺感染，也可通過血行播散和器官入侵引起免疫力低下病人致命的系統(tǒng)性感染，患者出現(xiàn)念珠菌血癥、心內(nèi)膜炎，中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、眼內(nèi)炎和骨髓炎，造成多器官功能的損害甚至死亡。在系統(tǒng)性白念珠菌感染過程中，強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)不僅對機(jī)體沒有有利作用，反而對機(jī)體器官組織造成損傷。IL-23

2、參與機(jī)體防御白念珠菌感染的天然免疫過程，IL-23產(chǎn)生后可刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生更多的促炎因子，并可作用于Th17細(xì)胞，激活獲得性免疫反應(yīng)，進(jìn)一步增強(qiáng)機(jī)體清除白念珠菌的能力，IL-23對Th17細(xì)胞的生存、增殖、再激活及產(chǎn)生IL-17是不可缺少的。因此，IL-23是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁。Hsp90是一個(gè)進(jìn)化保守、含量十分豐富的分子伴侶，不僅參與應(yīng)激反應(yīng)，還參與了炎癥反應(yīng)和天然免疫反應(yīng)過程，它影響著大量客戶蛋白的活性和信號(hào)通路的傳導(dǎo)。

3、本實(shí)驗(yàn)通過巨噬細(xì)胞與白念珠菌體外相互作用，探討巨噬細(xì)胞與白念珠菌體外相互作用后IL-23的表達(dá)分泌水平及Hsp90抑制劑對IL-23表達(dá)分泌水平的影響。
　　方法:
　　1、實(shí)驗(yàn)用小鼠
　　昆明種健康小鼠30只，雌性，清潔級(jí)，4-5周齡，15～20g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證編號(hào):1404078。
　　2、實(shí)驗(yàn)用菌株
　　白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC90028購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物研究所。

4、　　3、菌株的活化和菌懸液的配制
　　白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株復(fù)溫后在沙氏培養(yǎng)基上活化三次，加入含0.1％吐溫80的1640培養(yǎng)液，吸管吹打混勻，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整終濃度至1-2×106/mL。
　　4、巨噬細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定
　　小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分離法提取巨噬細(xì)胞，顯微鏡下計(jì)數(shù)，并用含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，巨噬細(xì)胞培養(yǎng)3天后取出。
　　巨噬細(xì)胞的鑒定采用形態(tài)學(xué)及免疫組化SP法:取出的巨噬細(xì)胞PBS洗

5、滌3遍，丙酮固定，常規(guī)HE染色、瑞士-吉姆薩染色及免疫組織化學(xué)SP法檢測巨噬細(xì)胞CD68抗原的表達(dá)，中性樹膠封固。
　　5、實(shí)驗(yàn)分組與處理
　　實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組。巨噬細(xì)胞培養(yǎng)3天后取出，離心洗滌后計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。用含10％胎牛血清1640培養(yǎng)液調(diào)整終濃度至5-6×105/mL，轉(zhuǎn)種至6孔板中，每孔2 ml，培養(yǎng)24小時(shí)后每孔加入濃度為1×106/mL菌懸液0.5 ml。
　　實(shí)驗(yàn)組每孔分別加入0.01μmol/L～0

6、.5μmol/L濃度的17-DMAG100μL，對照組加入同體積含10％胎牛血清1640培養(yǎng)液。0.1μmol/L濃度實(shí)驗(yàn)組及對照組分別于實(shí)驗(yàn)的第2、4、6、12小時(shí)收集細(xì)胞及上清液。不同濃度17-DMAG實(shí)驗(yàn)組于第4小時(shí)收集上清液。上清液-80℃凍存待測。各孔分別設(shè)3個(gè)平行孔。
　　6、流式細(xì)胞術(shù)檢測IL-23的表達(dá)水平
　　實(shí)驗(yàn)各組巨噬細(xì)胞從六孔板吹打下來后離心，PBS洗滌2遍，加入0.1％ TritonⅩ-100打孔，

7、避光孵育20分鐘，IL-23抗體染色，避光孵育15分鐘，流式細(xì)胞儀檢測巨噬細(xì)胞內(nèi)IL-23的表達(dá)水平，用FACSDivaSoftware軟件分析數(shù)據(jù)。
　　7、ELISA法檢測IL-23的分泌水平
　　實(shí)驗(yàn)各組收集的上清液復(fù)溫，按試劑盒說明操作，檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-23在蛋白水平的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、巨噬細(xì)胞培養(yǎng)形態(tài)觀察培養(yǎng)第一天倒置顯微鏡下可見巨噬細(xì)胞為圓形和橢圓形，貼壁生長。培養(yǎng)第三天，顯微鏡下可見

8、巨噬細(xì)胞體積略增大，為圓形，橢圓形，多角形，多數(shù)有偽足和凸起，貼壁生長。
　　2、巨噬細(xì)胞HE染色和瑞士-吉姆薩染色結(jié)果HE染色顯微鏡下可見巨噬細(xì)胞胞漿豐富，呈粉紅色，核大深藍(lán)色，瑞士染色顯微鏡下可見胞質(zhì)淡藍(lán)色，細(xì)胞核紫紅色。兩種染色均可見細(xì)胞核呈腎形，馬蹄形，偏居于一側(cè)。
　　3、巨噬細(xì)胞免疫組織化學(xué)結(jié)果CD68陽性反應(yīng)定位于培養(yǎng)巨噬細(xì)胞的胞膜及胞漿。
　　4、流式細(xì)胞術(shù)檢測巨噬細(xì)胞內(nèi)IL-23表達(dá)水平結(jié)果
　

9、　在實(shí)驗(yàn)的2h、4h、6h及12h，實(shí)驗(yàn)組IL-23表達(dá)水平分別為6.24±1.16，8.09±1.15，10.54±0.67及3.69±0.21。對照組IL-23表達(dá)水平分別為8.19±1.01，10.06±0.32，12.10±1.97及4.76±0.86。實(shí)驗(yàn)組和對照組IL-23的表達(dá)水平均隨著作用時(shí)間的延長先上升后下降，并在第6小時(shí)表達(dá)水平達(dá)高峰期。實(shí)驗(yàn)組表達(dá)水平明顯低于對照組，F(xiàn)=55.643 P=0.000P＜0.05，差異

10、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5、上清液中IL-23分泌水平檢測結(jié)果。
　　在實(shí)驗(yàn)的2h、4h、6h及12h，實(shí)驗(yàn)組IL-23表達(dá)水平(pg/m L)分別為225.17±7.95，243.60±5.81，257.61±12.48及259.19±7.92。對照組268.99±14.34,278.62±14.54,295.96±5.65及309.79±4.34。實(shí)驗(yàn)組和對照組IL-23的分泌水平均隨著作用時(shí)間的延長不斷升高，第6小時(shí)后增長

11、速度明顯減慢。實(shí)驗(yàn)組分泌水平明顯低于對照組，F(xiàn)=17.41P=0.000 P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　6、不同濃度HSP90抑制劑17-DMAG對上清液中IL-23分泌水平的影響。
　　0.01μmol/L，0.1μmol/L，0.25μmol/L及0.5μmol/L濃度17-DMAG實(shí)驗(yàn)組上清液IL-23分泌水平(pg/m L)分別為261.21±2.02，254.09±1.92，248.69±1.30，234.

12、41±3.81，隨抑制劑濃度升高，IL-23分泌水平相應(yīng)降低。 F=64.43 P=0.000 P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1、白念珠菌與小鼠腹腔巨噬細(xì)胞體外相互作用，隨著作用時(shí)間的延長，IL-23表達(dá)水平先上升后下降。
　　2、白念珠菌與小鼠腹腔巨噬細(xì)胞體外相互作用，加入HSP90抑制劑后，IL-23表達(dá)及分泌水平明顯下降。
　　3、HSP90抑制劑對白念珠菌刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌IL-