1、日本血吸蟲?。╯chistosomiasis）是制約我國養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展、危害我國人民健康的重要的人畜共患病之一。吡喹酮是目前唯一一種大規(guī)模使用的治療血吸蟲病的藥物，但已有喹酮耐藥蟲株出現(xiàn)的報道，使治療血吸蟲病新藥物研發(fā)更加緊迫。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲在不同適宜性宿主體內(nèi)的生長發(fā)育情況與蟲體體細(xì)胞凋亡現(xiàn)象具有一定的相關(guān)性，這為血吸蟲病新藥物靶標(biāo)的篩選提供了新的思路。日本血吸蟲凋亡誘導(dǎo)因子SjAIF是位于線粒體內(nèi)膜的一種蛋白，具有氧

2、化還原酶和促凋亡功能。本課題組前期工作鑒定到了SjAIF的堿基序列，為了闡述該基因的生物學(xué)特性和功能，本文展開了以下研究。
　　1.日本血吸蟲凋亡誘導(dǎo)因子編碼基因的克隆表達(dá)及生物學(xué)特性分析
　　通過PCR擴(kuò)增獲得日本血吸蟲凋亡誘導(dǎo)因子SjAIF基因的功能區(qū)片段，大小為828bp，編碼276個氨基酸。生物信息學(xué)分析表明該蛋白不含信號肽，理論等電點(diǎn)為6.61。對目的基因的功能結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)該基因片段包含一個4Lii（人線粒體凋亡誘

3、導(dǎo)因子1）的功能區(qū)、一個吡啶核苷酸-二硫化物氧化還原酶家族蛋白功能區(qū)及一個FAD/NAD(P)結(jié)合域超家族成員蛋白功能區(qū)。多重比對結(jié)果表明該基因所編碼的氨基酸序列與埃及血吸蟲的AIF相似性最高，達(dá)到68％。把擴(kuò)增到的日本血吸蟲凋亡誘導(dǎo)因子的功能區(qū)片段重組到原核表達(dá)載體pET-28a，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-SjAIF，并在大腸桿菌BL21（DE3）中誘導(dǎo)其表達(dá), SDS-PAGE分析表明重組蛋白分子量約為35kD。實(shí)時定量PC

4、R分析表明SjAIF基因在童蟲和成蟲的各個發(fā)育階段均有轉(zhuǎn)錄，其中7d、14d和21d蟲體表達(dá)量較低，42d和28d蟲體表達(dá)量較高，雌蟲表達(dá)量高于雄蟲。同時，對SjAIF在血吸蟲非適宜宿主大鼠和適宜宿主小鼠來源蟲體中的表達(dá)差異進(jìn)行分析，結(jié)果表明，SjAIF在大、小鼠來源的14d，23d，32d，42d四個時期蟲體中均有表達(dá)，且在這四個時期中大鼠來源蟲體的相對表達(dá)量均明顯高于小鼠來源蟲體。Western blotting結(jié)果表明重組蛋白具有

5、較好的抗原性和免疫原性。ELISA分析表明重組蛋白免疫小鼠后誘導(dǎo)產(chǎn)生了較高水平的特異性IgG抗體。應(yīng)用免疫組化分析顯示該蛋白主要存在于日本血吸蟲體被，少部份分布于實(shí)質(zhì)組織中。
　　2.SjAIF真核重組質(zhì)粒在293T細(xì)胞中的表達(dá)分析
　　通過PCR技術(shù)擴(kuò)增到SjAIF功能區(qū)片段，成功構(gòu)建了真核重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-SjAIF，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法把重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞。Western blotting分析結(jié)果表