1、近年來，國內(nèi)外大量研究報道指出，氧化應激是許多病理因素造成心血管損傷的共同機制。在許多心血管疾病的病理過程中都有過量氧自由基（包括過氧化氫、超氧陰離子等）產(chǎn)生，如高血壓、心力衰竭、缺血性心臟病、高脂血癥等，大量的氧自由基引起細胞氧化應激損傷，導致心肌細胞壞死和凋亡，大量的心肌細胞壞死和凋亡又進一步加重疾病的嚴重程度。因此，減輕氧化應激損傷，減少心肌細胞凋亡對心血管疾病的治療有重要的意義。過氧化氫（H2O2）作為一種重要的活性氧（reac

2、tive oxygen species, ROS）來源，能直接穿過細胞膜和細胞內(nèi)的鐵離子反應生成活性更強的自由基，因此H2O2誘導氧化應激是心肌細胞發(fā)生凋亡重要原因之一。目前由于內(nèi)源性抗氧化酶的不足，以及常規(guī)抗氧化劑體內(nèi)作用不穩(wěn)定，急需尋求針對氧化應激治療的新突破，因此我們開始立足于傳統(tǒng)中醫(yī)進行研究。
　　橙皮素（hesperetin, HES）是一種廣泛存在于花卉、水果、食品等植物源物質中且具有抗氧化、抗炎、抗衰老和降低血脂及抗

3、腫瘤等多種生物學活性的天然黃酮類化合物。新的研究發(fā)現(xiàn)橙皮素能抑制小鼠心肌肥大、纖維化進而保護心臟功能，但其是否通過調控氧化應激水平來減輕心肌細胞凋亡目前尚不清楚。因此本課題以橙皮素為研究對象，旨在了解橙皮素對心肌細胞氧化損傷的保護作用，并探討其發(fā)揮保護作用的可能機制。
　　大量研究發(fā)現(xiàn)，當有害刺激打破氧化應激的平衡狀態(tài)后，氧化應激可以通過線粒體、死亡受體、內(nèi)質網(wǎng)應激等途徑來介導細胞凋亡。而線粒體是決定細胞死亡與生存的關鍵因素，在凋

4、亡過程中，線粒體發(fā)生結構和功能的改變，由此發(fā)生凋亡相關蛋白釋放到胞質，進而激發(fā)下游的凋亡執(zhí)行者，引起細胞凋亡。已有的研究表明，橙皮素通過線粒體依賴的內(nèi)源性凋亡途徑降低LPS誘導的H9c2心肌細胞凋亡，然而橙皮素對心肌細胞氧化損傷的保護作用是否與線粒體依賴的內(nèi)源性凋亡有關，目前尚不清楚。本實驗主要從線粒體途徑來深入研究橙皮素保護心肌細胞氧化損傷的分子機制，為尋找橙皮素保護心肌損傷的新靶點提供依據(jù)。
　　第一部分橙皮素對H2O2誘導心

5、肌細胞氧化損傷的保護作用
　　目的：
　　觀察橙皮素預處理對H2O2誘導心肌細胞氧化損傷的保護作用，為后續(xù)橙皮素功能研究提供實驗依據(jù)。
　　方法：
　　培養(yǎng) H9c2細胞，建立 H2O2誘導心肌細胞氧化損傷模型，將細胞隨機分為四組：Control，H2O2，HES，HES+H2O2。采用 CCK-8檢測細胞存活率，確定H2O2最佳損傷濃度及HES最佳保護濃度；檢測心肌細胞MDA及SOD的含量以觀察H9c2心肌細胞

6、的活力；DCFH-DA熒光探針檢測ROS的生成；Hoechst33258染色、流式細胞儀檢測細胞凋亡。
　　結果：
　　1．氧化損傷模型建立
　　不同濃度的H2O2（25-800μM）作用2小時后，隨著H2O2處理濃度的升高，心肌細胞存活率逐漸降低，其中采用400μM H2O2處理2小時后，細胞損傷明顯且細胞存活率穩(wěn)定、適中，適于建立心肌細胞的氧化損傷性模型。
　　2．橙皮素對H9c2心肌細胞氧化損傷的保護作用<

7、br>　　2.1.藥物濃度確定
　　通過CCK-8檢測結果，確定橙皮素10-40μM預處理H9c2細胞1小時，可明顯減輕心肌細胞凋亡率，且在40μM時達到峰值，因此選取40μM作為后期實驗的保護濃度研究。
　　2.2. MDA、SOD活性檢測
　　橙皮素預處理1小時后，可以明顯減少 H2O2引起的 MDA（P<0.05）的產(chǎn)生，并提高細胞內(nèi)SOD（P<0.05）的水平。
　　2.3. DCFH-DA染色
　

8、　熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi)ROS的水平，H2O2處理后，綠色熒光明顯加強，心肌細胞ROS水平明顯提高（P<0.05）；橙皮素預處理后，明顯降低細胞內(nèi)ROS水平（P<0.05）。
　　2.4. Hoechst33258染色、流式細胞術、Caspase-3活性檢測結果
　　與正常對照組比，損傷模型組，強藍色熒光明顯加強，表明細胞膜對Hoechst的攝取增高，細胞凋亡率增加，細胞凋亡率為50％左右且Caspase-3活性明顯升高，橙皮

9、素1小時預處理后，細胞凋亡率明顯減弱，凋亡率為30%左右且Caspase-3的活性明顯下降。
　　結論：
　　1.橙皮素預處理能保護H2O2誘導的心肌細胞氧化損傷，并在40μM的時候達到最大保護作用。
　　2.橙皮素預處理減輕H2O2誘導的心肌細胞氧化損傷可能與減少心肌細胞凋亡有關。
　　第二部分橙皮素對H2O2誘導心肌細胞氧化損傷的保護作用的機制研究
　　目的：
　　觀察橙皮素發(fā)揮心肌細胞氧化損傷的

10、保護效應的可能機制。
　　方法：
　　培養(yǎng) H9c2心肌細胞，隨機分為四組：Control，H2O2，HES，HES+H2O2。提取蛋白檢測 Caspase-8、9、12的活性；JC-1染色檢測線粒體膜電位；提取蛋白測定ATP水平；Western blot方法檢測Bcl-2、Bax、細胞色素c的蛋白表達水平。
　　結果：
　　1. Caspase-8、9、12活性檢測結果：與正常對照組相比，H2O2損傷模型組Ca

11、spase-8、9、12(P<0.05）的活性明顯增加；橙皮素預處理能明顯的降低Caspase-8、9、12（P<0.05）的活性，且Caspase-9活性降低較為明顯。
　　2. JC-1染色結果：與正常對照組相比，給予H2O2處理2小時組，倒置顯微鏡觀察紅色熒光明顯減弱，綠色熒光明顯加強，表明線粒體基質中聚合體形式的JC-1較少，線粒體膜電位下降；橙皮素預處理后，紅色熒光加強，綠色熒光減弱，表明線粒體膜電位有所逆轉。
　

12、　3. ATP檢測結果：與正常對照組相比，H2O2損傷模型組，ATP水平明顯下降；橙皮素預處理后，ATP水平明顯升高。
　　4. Western blot檢測結果：與正常組相比，H2O2損傷模型組心肌細胞Bcl-2表達水平明顯下降，Bax、Cyt c表達水平顯著升高；橙皮素預處理上調了Bcl-2的表達，下調了Bax、Cyt c的表達。
　　結論：
　　1.橙皮素預處理可以減低Caspase-8、9、12活性且Caspa