1、一、目的:
　　 近年來，國內(nèi)外大量研究文獻都表明氧化應激是許多病理因素造成心血管損傷的共同機制，在許多心血管疾病的病理過程中都有過量氧自由基產(chǎn)生，同時抗氧自由基防御機制卻受到抑制，如動脈粥樣硬化(AS)、高血壓病、缺血性心臟病、高脂血癥等。氧化應激損傷心肌細胞的轉(zhuǎn)歸與氧化應激的程度相關(guān)，在一定應激強度范圍內(nèi)，氧化應激對心肌細胞造成的損傷是可逆的，而超過一定限度，則對心肌細胞造成不可逆的損傷，主要包括心肌細胞的凋亡和壞死。

2、>　　 原癌基因Pim(Proviral integration site of murine)家族是哺乳動物細胞中的絲/蘇氨酸激酶，屬于鈣調(diào)蛋白依賴性的蛋白激酶，包括Pim-1、Pim-2和Pim-3。大量的實驗研究已證實，Pim激酶的上調(diào)與細胞凋亡的抑制存在顯著的相關(guān)性。Pim-2持續(xù)表達能夠促進細胞長期抵抗各種凋亡信號的刺激。研究證實Pim-1在Akt通路中保護心肌細胞損傷，而在Pim-1缺失小鼠中Pim-2的表達增高了4.6倍

3、;Pim-1缺失小鼠在心梗后7天，Pim-2的表達增高2.75倍。但Pim-2在心肌細胞中的表達及作用尚缺乏研究，有必要探討Pim-2在心肌細胞損傷中的作用及機制。
　　 三七是具有多種心血管活性的中藥，臨床廣泛應用于心血管疾病的防治?，F(xiàn)代化學和藥理學研究發(fā)現(xiàn)三七總皂苷(Panax notoginseng saponin，PNS)是三七的主要活性成分，含有多種單體皂苷主要有:人參皂苷Rb1，人參皂苷Rg1，三七皂苷R1。本課題以

4、三七皂苷R1為研究對象，旨在了解三七皂苷R1對心肌細胞損傷的保護作用，并探討其參與調(diào)節(jié)的細胞信號通路，凋亡相關(guān)蛋白，并了解其對Pim-2的調(diào)控作用。
　　 二、方法:
　　 1.乳鼠心肌細胞的原代培養(yǎng)外科無菌條件下取出乳鼠心臟，用胰酶4℃過夜，終止消化，再用膠原酶消化液逐步消化法分離單個心肌細胞，接種至培養(yǎng)瓶中，采取差速貼壁分離法以去除心肌成纖維細胞，得到純度較高的心肌細胞用于實驗。
　　 2.H2O2致心肌細胞

5、氧化應激模型建立心肌細胞正常培養(yǎng)2-3天后，選取細胞密度在80％-95％以上的，自律性搏動120～140次/min的心肌細胞用于實驗，選取不同濃度與時間點的H2O2干預心肌細胞，選擇合適的濃度及干預時間用于后續(xù)實驗。
　　 3.三七皂苷R1預處理心肌細胞心肌細胞培養(yǎng)的第2-3天，細胞生長接近80％融合時，心肌細胞預先用不同濃度三七皂苷R1培養(yǎng)24h，進行三七皂苷R1毒性測試，選取合適的高、中、低劑量組進行相關(guān)后續(xù)實驗。
　

6、　 4.MTT比色法測定心肌細胞活力將心肌細胞接種于九十六孔板，按實驗分組給予相應的處理因素后，按MTT法具體操作步驟進行操作，在酶標儀490nm處測其OD值并計算各組心肌細胞存活率。
　　 5.流式細胞術(shù)檢測心肌細胞凋亡率心肌細胞按照實驗分組處理后，用不含EDTA的胰酶消化收集，以Annexin V-FITC/Propidium Iodide進行染色，室溫、避光、反應5～15min，上流式細胞儀(激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長

7、530nm)進行檢測。
　　 6.心肌細胞LDH、MDA、SOD的檢測將心肌細胞接種于六孔培養(yǎng)板中，按不同實驗目的進行分組處理，處理完畢后，分別按照LDH、MDA、SOD檢測試劑盒說明書進行操作，在酶標儀420nm處測量每組OD值并計算各組細胞內(nèi)LDH、MDA、SOD的含量。實驗重復三次以上。
　　 7.實時定量PCR檢測心肌細胞內(nèi)Pim-2 mRNA的表達心肌細胞按照2×107/孔的濃度接種至六孔板中，取正常培養(yǎng)2-3

8、天后狀態(tài)最佳的心肌細胞用于實驗。實驗分組依次為:正常對照組、H2O20.5、1、2、3、6h五個時間組，50μMH2O2干預心肌細胞。用Trizol提取心肌細胞總RNA，在紫外分光光度計上測定OD260/OD280，鑒定提取的RNA純度和濃度。然后，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，根據(jù)Gene Bank中Pim-2、GAPDH的基因序列資料，借助于計算機軟件PrimerPremier5.0設計引物，上機進行目的基因的熒光定量檢測。
　　 8

9、.SiRNA沉默心肌細胞Pim-2基因調(diào)合適的細胞濃度分別接種于六孔板或九十六孔板中，正常培養(yǎng)2-3天左右，當貼璧細胞達到80％～90％融合時，取狀態(tài)良好的細胞進行實驗。siPORTTM NeoFXTM轉(zhuǎn)染試劑與DMEM培養(yǎng)基混勻室溫孵育15min， siRNA稀釋液等體積混勻，孵育15min。然后將混合液加入培養(yǎng)板混勻。轉(zhuǎn)染心肌細胞48～72h后收集細胞，再進行Western blot實驗和流式細胞術(shù)檢測心肌細胞凋亡率。
　　

10、 9.Western blot法檢測心肌細胞蛋白的表達心肌細胞按實驗分組處理完成后，以Western及IP細胞裂解液提取心肌細胞蛋白，BCA法進行蛋白定量，進行蛋白印跡實驗。以Actin為內(nèi)參，將處理好的蛋白質(zhì)樣品進行SDS-PAGE分離，電泳結(jié)束后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉后，孵育一抗和二抗，ECL顯色，KODAK Image Station2000MM成像系統(tǒng)采集圖像，獲得圖像用圖像處理軟件Image Tool3.0測定并分析

11、條帶灰度值以檢測目的蛋白的表達水平。
　　 10.統(tǒng)計分析實驗數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料數(shù)據(jù)以(x)±s表示。對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗。若符合正態(tài)分布和方差齊性，則采用方差分析。若不符合正態(tài)分布和方差齊性，則采用秩和檢驗。方差齊性時兩兩比較采用LSD法，方差不齊時兩兩比較采用Tamhane's T2法。多組計數(shù)資料的比較（各組AV評分）采用完全隨機設計資料的Kruskal-Wallis檢驗方法。

12、各實驗組不同缺血及再灌注時間點血流動力學指標采用重復測量方差分析。檢驗顯著性水準α=0.05。
　　 三、結(jié)果:
　　 1.三七皂苷R1對H2O2誘導的心肌細胞損傷的作用
　　 1.1 H2O2對心肌細胞損傷的濃度效應關(guān)系MTT比色法檢測不同濃度H2O2干預心肌細胞3h后，細胞活力顯著降低，光鏡下可看到細胞搏動減弱甚至停止，細胞密集區(qū)域出現(xiàn)大片細胞脫落。與正常對照組比較，H2O2干預的各組細胞活力均有所下降，經(jīng)統(tǒng)

13、計分析各組差異均有統(tǒng)計學意義(F=734.372，P＜0.001)，且隨著H2O2濃度的增加各組細胞活力出現(xiàn)遞減趨勢。
　　 1.2不同濃度三七皂苷R1對心肌細胞活力的影響不同濃度三七皂苷R1預處理心肌細胞24h，比較各濃度三七皂苷R1作用后細胞活力與正常對照組的差異。經(jīng)統(tǒng)計分析，三七皂苷R1濃度為0.1×10-6mol/L、1×10-6mol/L、10×10-6mol/L時細胞活力與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P均＞0.0

14、5），而濃度為50×10-6mol/L、100×10-6mol/L時，作用心肌細胞24h后細胞活力較正常對照組顯著降低(P＜0.001)。
　　 1.3三七皂苷R1預處理對H2O2干預的心肌細胞活力的影響三七皂苷R1低、中、高濃度（0.1×10-6mol/L、1×10-6mol/L、10×10-6mol/L）預處理心肌細胞24h，然后以H2O2(50μmol/L)作用細胞3h，同時設立正常對照組、模型組，比較各不同濃度三七皂苷R

15、1對H2O2誘導的心肌細胞活力的影響。經(jīng)統(tǒng)計分析表明，各組間細胞活力差異有統(tǒng)計學意義((F=519.758，P＜0.001)。三七皂苷R1預處理后可呈濃度依賴性減輕H2O2處理后心肌細胞活力的下降。
　　 1.4三七皂苷R1預處理對H2O2干預的心肌細胞凋亡率的影響流式細胞術(shù)檢測各組心肌細胞凋亡率，比較各不同濃度三七皂苷R1對H2O2誘導的心肌細胞凋亡率的影響。經(jīng)三七皂苷R1預處理后，各組細胞凋亡與模型組相比有所減少，尤其是高濃

16、度組的凋亡情況顯著改善。經(jīng)統(tǒng)計分析，各組差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.0001)。
　　 1.5三七皂苷R1預處理對H2O2干預的心肌細胞LDH、MDA、SOD的影響試劑盒檢測各組心肌細胞LDH、MDA、SOD值，結(jié)果與正常對照組比較，模型組心肌細胞SOD活性顯著降低，而LDH活性、MDA含量則顯著增加(P＜0.001);三七皂苷R1可呈劑量依賴性增加SOD活性，降低LDH活性、MDA含量，各組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.0

17、01)。
　　 2三七皂苷R1對H2O2誘導的心肌細胞凋亡信號通路、凋亡相關(guān)蛋白表達的影響
　　 2.1三七皂苷R1預處理對H2O2干預的心肌細胞MAPK信號通路的影響
　　 2.1.1 Western Blot檢測各組細胞中P-ERK1/2、總ERK1/2蛋白表達的變化，分析目的條帶的光密度值(IOD)。與正常組相比，模型組(H2O2) P-ERK1/2表達顯著提高，三七皂苷R1低、中、高劑量組與模型組相比P-

18、ERK1/2表達顯著降低，其中高劑量組表達降低最為顯著。各組間P-ERK1/2表達存在顯著差異(P＜0.01)。
　　 2.1.2 Western Blot檢測各組細胞中P-JNK、總JNK蛋白表達的變化，分析目的條帶的光密度值(IOD)。與正常組相比，模型組(H2O2) P-JNK表達顯著提高(P＜0.001)，三七皂苷R1低、中、高劑量組與模型組相比表達無顯著差異(P＞0.05)。
　　 2.1.3 Western

19、Blot檢測各組細胞中P-P38、總P38蛋白表達的變化，分析目的條帶的光密度值(IOD)。與正常組相比，模型組(H2O2) P-P38表達顯著提高(P＜0.001)，三七皂苷R1低、中、高劑量組與模型組相比P-P38表達無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 2.2三七皂苷R1預處理心肌細胞凋亡蛋白Bax/Bcl-2表達的變化用WesternBlot檢測各組細胞中Bax、Bcl-2蛋白表達的變化，分析目的條帶的光密度值(IOD)

20、，正常組Bax、Bcl-2有一定量的表達，與正常組相比，模型組Bax表達顯著增高，三七皂苷R1低、中、高劑量組與模型組相比表達逐漸降低(P＜0.001);與正常組相比，模型組Bcl-2表達量降低，三七皂苷R1低、中、高劑量組與模型組相比表達逐漸增高(P＜0.001)。與正常組相比，模型組Bax/Bcl-2值顯著增高，三七皂苷R1低、中、高劑量組與模型組相比表達逐漸降低(P＜0.001)。
　　 3 Pim-2在H2O2誘導的心肌

21、細胞損傷中的表達及作用
　　 3.1 H2O2顯著上調(diào)心肌細胞內(nèi)Pim-2 mRNA的表達用濃度為50μmol/L的H2O2干預心肌細胞0.5、1、2、3、6h，實驗設正常對照組。應用實時熒光定量PCR的方法檢測各組心肌細胞內(nèi)Pim-2 mRNA的表達時發(fā)現(xiàn)，H2O2干預后的心肌細胞Pim-2 mRNA的表達有所增加，各組差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。其中H2O20.5、1h組與正常對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.0

22、56);其余各濃度組與正常對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)，尤其是H2O23h組Pim-2mRNA的水平增加最顯著;H2O26h組心肌細胞Pim-2 mRNA表達水平有所降低，但仍高于正常對照組。
　　 3.2 H2O2顯著上調(diào)心肌細胞內(nèi)Pim-2蛋白的表達應用Western blot法檢測H2O2干預不同時間后心肌細胞內(nèi)Pim-2的蛋白水平發(fā)現(xiàn)，H2O2干預后的心肌細胞Pim-2蛋白表達增高，其增高的趨勢與實時

23、熒光定量PCR檢測出的Pim-2mRNA增高趨勢一致，各組差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。
　　 3.3 Pim-2 siRNA干擾對細胞凋亡的影響實驗分為正常組，H2O2組，siRNA組(H2O2+siRNA)，陰性對照組(H2O2+NC)。結(jié)果顯示模型組與正常組相比，細胞凋亡率顯著增加，siRNA干擾組細胞凋亡率進一步增加(P＜0.001)，陰性對照組與模型組相比無顯著差異(P＞0.05)，與正常組相比顯著增加(P＜0.

24、001)。
　　 3.4 Pim-2 siRNA干擾對細胞LDH、MDA、SOD的影響心肌細胞經(jīng)Pim-2siRNA干擾后，心肌細胞SOD活性較模型組顯著降低，而LDH、MDA含量較模型組顯著增高，各指標組間差異具有統(tǒng)計學意義(P＜.001)，陰性對照組與模型組相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 4 Pim-2蛋白表達調(diào)控
　　 4.1三七皂苷R1上調(diào)Pim-2蛋白的表達通過Western Blot技術(shù)

25、檢測各組心肌細胞Pim-2蛋白表達，結(jié)果顯示模型組(H2O2)與正常組相比Pim-2表達顯著增高，三七皂苷R1各劑量組Pim-2表達進一步增高，其中三七皂苷R1高劑量組表達增高最為顯著，各組間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　 4.2 Pim-2 siRNA干擾對三七皂苷R1預處理心肌細胞凋亡率的影響實驗分為正常組、模型組(H2O2)、三七皂苷R1組(H2O2+NG R110μM)、siRNA轉(zhuǎn)染組(H2O2+NG R11

26、0μM+siRNA)、siRNA陰性對照組。流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡率，結(jié)果模型組與正常組相比凋亡率顯著增高(P＜0.001)，三七皂苷R1組與模型組相比顯著下降，siRNA組、siRNA陰性對照組與三七皂苷R1組相比無顯著差異(P＞0.05)。
　　 4.3 Pim-2 siRNA干擾對心肌細胞Bax/Bcl-2表達的影響實驗分為正常組，H2O2組，siRNA組(H2O2+siRNA)，陰性對照組。用WB檢測各組細胞中Bax

27、、Bcl-2蛋白表達的變化，分析目的條帶的光密度值(IOD)，與正常組相比，(.)模型組Bax表達顯著增高，siRNA組與模型組相比表達進一步增高(P＜0.01)，陰性對照組與模型組相比Bax表達無顯著差異。與正常組相比，模型組Bcl-2表達量降低，siRNA組與模型組相比表達進一步降低(P＜0.01)，陰性對照組與模型組相比無顯著差異。模型組與正常組相比，Bax/Bcl-2值顯著增高，siRNA組進一步增高(P＜0.01)，陰性對照組

28、無顯著差異。
　　 四、結(jié)論:
　　 1、H2O2能抑制心肌細胞活力，促進心肌細胞凋亡的發(fā)生，導致氧化平衡體系的破壞。三七皂苷R1可以抑制H2O2誘導的心肌細胞損傷，增強心肌細胞活力，保護心肌細胞凋亡，增強細胞抗氧活酶活力。
　　 2、H2O2促進心肌細胞ERK、JNK、P38的磷酸化，三七皂苷R1下調(diào)H2O2干預的心肌細胞中ERK的磷酸化，而對JNK、P38的磷酸化無顯著調(diào)控。三七皂苷R1下調(diào)H2O2干預的心肌

29、細胞中Bax蛋白的表達，上調(diào)Bcl-2蛋白的表達。表明三七皂苷R1抗心肌細胞凋亡與調(diào)節(jié)ERK信號通路、凋亡相關(guān)蛋白有關(guān)。
　　 3、H2O2能誘導心肌細胞中Pim-2激酶的表達，Pim-2 siRNA干擾可有效沉默Pim-2基因，Pim-2蛋白表達對心肌細胞損傷其保護作用。
　　 4、三七皂苷R1上調(diào)H2O2干預的心肌細胞中Pim-2的表達，但siRNA干擾Pim-2后，三七皂苷R1仍能抗心肌細胞凋亡，表明三七皂苷R1抗