1、研究背景及目的：革蘭陽性或革蘭陰性細菌、病毒等病原微生物感染機體時，這些病原微生物釋放LPS、肽聚糖(PGN)等活性成分，與炎癥反應(yīng)細胞的表面受體模式識別并結(jié)合，引起一系列胞內(nèi)信號事件和效應(yīng)分子的級聯(lián)釋放，介導膿毒癥的發(fā)生發(fā)展。
　　脂多糖/內(nèi)毒素(LPS)是介導膿毒癥發(fā)生最常見的致病因子，由類脂 A、核心多糖和 O-抗原三部分共價連接而成。LPS與其模式識別受體TLR4(toll-like receptor4)結(jié)合，沿著MyD8

2、8依賴及TRAM-TRIF依賴兩條途徑啟動細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導，活化NF-κB(nuclear factor kappa B)和IRF-3(interferon regulatory factor3)，導致腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、趨化因子等多種效應(yīng)分子的合成和釋放。
　　4-氨基喹啉類抗瘧藥氯喹(CQ)，是一種弱堿性藥物，抑制內(nèi)體和溶酶體的酸化成熟。本課題組早前發(fā)現(xiàn)，CQ顯著提高膿毒癥小鼠的總體生存率，負

3、調(diào)控LPS刺激人外周血單個核細胞(hPBMC)和小鼠巨噬細胞(ANA-1)上清中TNF-α和IL-6的釋放。且其他研究同樣證實CQ具有較廣譜的抗炎活性，如CQ提高多種微生物混合感染所致膿毒癥小鼠的總體生存率、減輕腎功能損傷和脾細胞凋亡。因此，本課題組從04年開始進行CQ抗炎的相關(guān)研究，并在前期大量工作中發(fā)現(xiàn)CQ抑制LPS介導單核/巨噬細胞的活化、影響LPS-TLR4復合物的內(nèi)化和解離、影響細胞膜表面受體 TLR4的表達等。此外還發(fā)現(xiàn)，C

4、Q上調(diào)小泛素相關(guān)修飾物特異性蛋白酶(SENP6)的蛋白表達，減少TNF-α、IL-6、IFN-γ等炎癥介質(zhì)的釋放。
　　SUMO是類泛素分子，酶催化下共軛結(jié)合在底物蛋白賴氨酸殘基上的過程稱為SUMO化(SUMOylation)，是一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的亞細胞定位和空間結(jié)構(gòu)，參與NF-κB通路和STAT信號調(diào)控。SUMO是酶催化的可逆反應(yīng)，因此SUMO在泛素樣修飾物蛋白酶(ULP)/去SUMO化酶催化下可從底物蛋白的賴氨

5、酸殘基上解離。SENP6是一種去SUMO化酶，介導IRF3或IRF7的去SUMO化負反饋抑制IFN的轉(zhuǎn)錄。我們研究發(fā)現(xiàn)CQ上調(diào)SENP6的蛋白表達，后者誘導NF-κB的去SUMO化，下調(diào)TNF-α、IFN-γ等炎癥介質(zhì)的釋放。SUMO和泛素分子結(jié)構(gòu)有高度的同源性，SUMO化和泛素化修飾過程相仿，雖然 SUMO化和泛素化的修飾位點存在相互競爭，CQ可上調(diào)去SUMO化酶SENP6直接作用于NF-κB調(diào)節(jié)LPS誘導巨噬細胞活化，那么進行同向類

6、比，CQ是否也可以上調(diào)去泛素化酶的表達作用于NF-κB之外的其他信號分子調(diào)控LPS-TLR4通路？
　　泛素(ubiquitin)是由76個氨基酸組成的小分子蛋白，在 E1、E2、E3的順序作用下連接到底物蛋白賴氨酸殘基，發(fā)揮不同的生物學功能。泛素和 E1、E2、E3及26S蛋白酶體組成泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)，作為真核細胞中主要溶酶體非依賴的蛋白降解途徑，參與炎癥、信號轉(zhuǎn)導、細胞凋亡等多種生物學活動。泛素在不同E2和E3的催

7、化下通過其分子結(jié)構(gòu)中存在的蛋氨酸和賴氨酸殘基形成8種不同拓撲結(jié)構(gòu)和功能的多聚泛素鏈，這個過程叫泛素化。泛素化是酶催化的可逆反應(yīng)，去泛素化酶(DUBs)催化靶蛋白上連接的多聚泛素鏈與底物蛋白的解離。人基因組約編碼五大類 DUB，N末端卵巢癌型蛋白酶(OTU)、泛素C末端水解酶(UCH)、泛素特異性蛋白酶(USP)、馬查多-約瑟夫病蛋白酶(MJD)和金屬蛋白酶(metalloproteases)，其中研究較多的是USP家族和OTU家族去泛素

8、化酶。
　　細胞表面受體的內(nèi)化和轉(zhuǎn)運同樣參與細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導，LPS與TLR4結(jié)合，內(nèi)化進入早期內(nèi)體，逐漸酸化成熟形成晚期內(nèi)體并與溶酶體融合，在早期內(nèi)體-晚期內(nèi)體-溶酶體動態(tài)變化過程中，早期內(nèi)體含有特殊的小半鞘，其中包含轉(zhuǎn)運所需內(nèi)體分選復合物(ESCRT)，由ESCRT分選出的泛素化標記的膜蛋白轉(zhuǎn)運至溶酶體降解。有研究證實，E3或DUB與ESCRT的相互作用調(diào)節(jié)表面受體的內(nèi)化和轉(zhuǎn)運，調(diào)控細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導。溶酶體主要參與內(nèi)化物質(zhì)的分解代

9、謝和再循環(huán)，蛋白酶體則主要參與功能或結(jié)構(gòu)異常蛋白的降解。既已證實CQ有較廣譜的抗炎活性，且本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，CQ預(yù)處理 Raw264.7細胞中 LPS與TLR4共定位現(xiàn)象消失，且細胞膜表面TLR4受體表達減少；我們考慮CQ是酸化抑制劑，抑制內(nèi)體和溶酶體酸化成熟，似乎CQ促進LPS-TLR4解離、降低膜表面受體TLR4的表達與溶酶體關(guān)聯(lián)不大。因此進一步猜想CQ是否通過泛素-蛋白酶體途徑增加LPS-TLR4的分離與降解而參與抑制LPS誘

10、導巨噬細胞活化的？
　　綜上所述，本課題從CQ抑制LPS誘導巨噬細胞活化的研究切入，藉由泛素-蛋白酶體途徑阻斷對不同炎癥介質(zhì)釋放的效應(yīng)入手，闡述CQ負調(diào)控LPS-TLR4通路可能的分子機制。因此，本課題先篩選CQ對不同DUB分子mRNA表達的影響，進一步探討鋅指蛋白 A20和泛素特異性蛋白酶 USP25通過影響信號通路中間分子的活性，影響TLR4介導下游信號通路的活化和炎癥介質(zhì)釋放的可能機制。
　　研究方法：
　　1.

11、 CQ影響OTU和USP家族去泛素化酶mRNA表達的篩選研究：20ug/ml終濃度CQ預(yù)處理Raw264.7細胞1h，加100ng/ml濃度的LPS刺激2h；熒光定量PCR檢測DUBs的mRNA表達。
　　2.鋅指蛋白A20調(diào)控CQ抑制LPS-TLR4通路的機制研究：
　　2.1. CQ對Raw264.7細胞A20表達水平的影響：用不同濃度(0、5、10、20ug/ml)CQ預(yù)處理Raw264.7細胞24h，A20的mRNA

12、和蛋白表達水平以PCR和western blot(WB)法分別檢測CQ對A20表達的劑量-效應(yīng)關(guān)系；并以達到A20最大表達水平的劑量預(yù)處理Raw264.7細胞1h，LPS刺激4h確定CQ對LPS活化Raw264.7細胞中A20的mRNA和蛋白表達水平。
　　2.2. siRNA沉默A20表達變化導致的LPS-TLR4通路的影響：
　　(1) siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)將公司設(shè)計合成的3條siRNA轉(zhuǎn)染Raw264.7細胞24-48h

13、， A20的基因及蛋白水平分別用PCR和WB評估不同的干擾表達效果，選擇干擾效果最優(yōu)的siRNA建立干擾模型；
　　(2) siRNA干擾A20表達，CQ預(yù)處理1h，LPS刺激4h，RT-PCR檢測TNF-α和IL-6的mRNA表達；WB檢測MAPK p38及其磷酸化水平；
　　(3) siRNA干擾A20，CQ預(yù)處理1h，LPS刺激1h，激光共聚焦檢測NF-κB和IRF3的核轉(zhuǎn)位情況。
　　3.泛素特異性蛋白酶USP

14、25調(diào)控CQ抑制LPS誘導巨噬細胞活化的機制研究：3.1 CQ影響Raw264.7細胞USP25表達情況：梯度劑量(0、5、10、20ug/ml)CQ
　　預(yù)處理小鼠Raw264.7細胞或人THP-1細胞24h，PCR和WB分別檢測USP25的mRNA和蛋白表達的劑量-效應(yīng)關(guān)系；并以最大表達劑量的CQ預(yù)處理Raw264.7細胞1h，LPS刺激4h確定CQ對LPS活化Raw264.7細胞中USP25的mRNA和蛋白表達水平。

15、　　3. siRNA干擾USP25表達對CQ抑制LPS誘導巨噬細胞活化的影響：
　　(1) siRNA轉(zhuǎn)染Raw264.7細胞24-48h，PCR和WB評估m(xù)RNA和蛋白水平干擾表達效果，建立干擾模型；
　　(2) siRNA干擾USP25表達，CQ預(yù)處理1h，LPS刺激4h，RT-PCR檢測TNF-α、IL-6和IFN-β的mRNA表達；WB檢測TLR4下游信號分子IκB、NF-κB和MAPKs通路分子p38、ERK、JN

16、K及其磷酸化水平；
　　(3) siRNA干擾USP25表達，CQ預(yù)處理1h，LPS刺激24h，ELISA檢測TNF-α、IL-6和IFN-β的釋放水平；
　　(4) siRNA干擾USP25表達，CQ預(yù)處理1h，LPS刺激4h或12h，ELISA檢測NF-κB亞基p65和p50的活化情況；
　　(5) siRNA干擾USP25，CQ預(yù)處理1h，LPS刺激1h，激光共聚焦檢測NF-κB和IRF3轉(zhuǎn)位入核變化；
　

17、　4. A20和USP25調(diào)控CQ抑制LPS誘導巨噬細胞活化的相互作用研究：
　　(1) siRNA共轉(zhuǎn)染雙干擾A20和USP25，CQ預(yù)處理1h，LPS刺激24h，ELISA檢測上清中TNF-α、IL-6和IFN-β的釋放水平；
　　(2) siRNA共轉(zhuǎn)染雙干擾A20和USP25，CQ預(yù)處理1h，LPS刺激4h，WB檢測MAPK p38及其磷酸化水平；
　　(3) siRNA共轉(zhuǎn)染雙干擾A20和USP25，CQ預(yù)處

18、理1h，LPS刺激1h，激光共聚焦檢測NF-κB和IRF3入核情況。
　　5.統(tǒng)計學分析：計量資料以均值±標準差( X±S)表示，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，采用單因素方差分析進行統(tǒng)計處理，以p<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　研究結(jié)果：
　　1. CQ影響OTU和USP家族去泛素化酶mRNA表達的篩選研究：PCR結(jié)果顯示， CQ顯著上調(diào)OTU家族去泛素化酶A20和OTULIN的mRNA表達；CQ上調(diào)USP家族去泛

19、素化酶CYLD、USP2、USP3、USP4、USP7、USP8、USP25和USP28的mRNA表達。
　　2.鋅指蛋白A20調(diào)控CQ抑制LPS-TLR4通路的機制研究
　　(1) A20的mRNA和蛋白表達與CQ存在正向劑量-效應(yīng)關(guān)系，且A20的mRNA和蛋白表達在CQ預(yù)處理LPS刺激Raw264.7細胞中顯著增加；
　　(2) PCR和WB檢測3條公司設(shè)計合成的siRNA序列發(fā)現(xiàn)siRNA1干擾效果最明顯，因此以

20、siRNA1建立干擾模型并應(yīng)用在后續(xù)效應(yīng)實驗中；
　　(3) A20干擾表達，TNF-α和IL-6的mRNA表達顯著增加，p38磷酸化水平顯著上調(diào)，且NF-κB p65和IRF3的轉(zhuǎn)位入核明顯增加。
　　3.泛素特異性蛋白酶USP25調(diào)控CQ抑制LPS誘導巨噬細胞活化的機制研究
　　(1) USP25的mRNA和蛋白表達與CQ存在正向劑量-效應(yīng)關(guān)系，且在CQ預(yù)處理LPS刺激Raw264.7細胞中USP25的mRNA和蛋

21、白表達也增加；
　　(2) PCR和WB檢測siRNA干擾mRNA和蛋白表達情況，成功建立干擾模型并應(yīng)用在后續(xù)實驗中；
　　(3) USP25干擾表達，PCR結(jié)果顯示，TNF-α、IL-6和IFN-β的mRNA表達明顯增加；ELISA結(jié)果顯示，上清中TNF-α、IL-6和IFN-β釋放增加；WB結(jié)果顯示，MAPK通路p38、ERK和JNK磷酸化水平明顯上調(diào)，IκB降解增加，p-IκB磷酸化增加，NF-κB磷酸化也增加；NF-

22、κB ELISA結(jié)果顯示，NF-κB亞基p65和p50早期和晚期活化水平均明顯增加；共聚焦結(jié)果顯示，NF-κB和IRF3轉(zhuǎn)位入核明顯增加。
　　4. A20和USP25調(diào)控CQ抑制LPS誘導巨噬細胞活化的相互作用研究：A20和USP25雙干擾，ELISA結(jié)果顯示，TNF-α和IL-6的釋放減少，而IFN-β的釋放增加；WB結(jié)果顯示，p38磷酸化減少；共聚焦結(jié)果顯示，NF-κB p65入核減少，而IRF3入核未見明顯減少。
　

23、　研究結(jié)論：
　　1.確定CQ預(yù)處理對DUB分子mRNA表達的調(diào)節(jié)作用，CQ上調(diào)多數(shù)USPs、A20及CYLD的mRNA表達。
　　2. CQ預(yù)處理A20和USP25的表達上調(diào)可能改變LPS-TLR4通路中NF-κB外其他信號分子的生物學活性，進而影響 NF-κB的活化和炎癥介質(zhì)的釋放。A20或 USP25干擾表達均會造成CQ抑制LPS-TLR4通路效應(yīng)的阻斷；但A20和USP25干擾表達CQ抑制NF-κB和MAPK通路的活