1、背景和目的：
　　 潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)，反復(fù)發(fā)作，遷延不愈，容易癌變。臨床資料分析表明，UC病程8-15年，癌變發(fā)生率達22％，10-20年達28％，20年以上則高達43％。目前，結(jié)直腸癌的預(yù)防措施有:消除不良飲食習(xí)慣，服用化學(xué)預(yù)防藥物，早期診斷及時治療;其中針對性的化學(xué)預(yù)防可望在UC癌變中取得突破。UC癌變是一個漫長的過程，預(yù)防UC癌變不僅需要明確的藥物作用靶點，而且需要預(yù)防藥物無毒、無

2、副作用。
　　 研究表明，核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)是UC癌變的中心環(huán)節(jié)，其表達水平是炎癥癌變的控制器。眾所周知，結(jié)腸腔內(nèi)存在大量共生菌及食物消化殘渣，對結(jié)腸粘膜上皮細(xì)胞具有潛在的侵襲作用。正常情況下，結(jié)腸粘膜一方面靠本身分泌的粘液加以保護，另一方面靠其表面存在的各種模式識別受體通過識別不同病原生物性物質(zhì)，啟動免疫反應(yīng)，維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。臨床研究發(fā)現(xiàn)，UC患者腸道菌群發(fā)生改變，G-/G+菌比值顯著增加。
　　 我們的

3、研究發(fā)現(xiàn)，糖聚合度為5的β-(1→4)-半乳寡糖醛酸(AOG)可顯著預(yù)防實驗性結(jié)腸炎癌變(93.5％)，動物用藥4個月，未見到任何毒性反應(yīng)。AOG單獨使用可引起結(jié)腸上皮細(xì)胞膜TLR-4的表達升高，而與LPS合用卻顯著降低了TLR-4在細(xì)胞膜的表達。但其結(jié)合位點及分子機制尚不明確。
　　 而TLR-4與LPS的構(gòu)象研究揭示，TLR-4激動劑LPS正是促進了MD-2-TLR-4寡聚化，升高細(xì)胞膜TLR-4的表達水平;而TLR-4的拮

4、抗劑（Eritoran）則抑制MD-2-TLR-4的寡聚化，降低細(xì)胞膜TLR-4的表達，從而降低NF-κ3的活化水平，抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生。提示，影響TLR-4在膜的表達，調(diào)控NF-κB的活性，將是發(fā)掘UC癌變預(yù)防藥物的可行之路。
　　 本課題擬通過構(gòu)建TLR-4、MD-2野生型及突變體慢病毒載體，CD-14慢病毒載體，TLR-4、MD-2基因敲除慢病毒載體;并構(gòu)建TLR-4/MD-2/NF-κB-luciferase信號通路在H

5、EK293T細(xì)胞中的表達。觀察AOG、LPS單獨和聯(lián)合使用對TLR-4/MD-2/NF-κB信號通路的影響;觀察TLR-4和MD2敲除后，AOG和LPS處理HT-29細(xì)胞對TLR-4/MD-2/NF-κB信號通路的影響;觀察過表達TLR-4和MD2，對AOG和LPS誘導(dǎo)的TLR-4/MD-2/NF-κB信號通路活化的影響;觀察TLR-4和MD-2突變體對LPS和AOG誘導(dǎo)的TLR-4/MD-2/NF-κB-luciferase信號通路的

6、影響。從而揭示AOG預(yù)防結(jié)腸炎癌變的分子機制。
　　 實驗方法：
　　 1、用ELISA試劑盒測定上清中TNF-α的釋放量，觀察AOG和LPS對HT-29細(xì)胞TNF-α釋放水平的影響;
　　 2、用Western Blotting來檢測HT-29細(xì)胞中NF-κB P65亞基磷酸化水平，從而判斷AOG和LPS對NF-κB活化程度的影響;
　　 3、用Cell Surface Biotinylation方法在

7、HT-29細(xì)胞中檢測AOG、LPS單獨和聯(lián)合使用對細(xì)胞表面TLR-4表達水平的影響;
　　 4、以慢病毒為載體，通過shRNA對TLR-4和MD-2蛋白干擾沉默后，用qRT-PCR檢測shRNA的干擾效果，進而對TLR-4以及MD-2的shRNA進行篩選。
　　 5、以慢病毒為載體，利用篩選出的shRNA對TLR-4和MD-2干擾沉默后，分別加入LPS及AOG，用ELISA試劑盒測定上清中的TNF-α的含量，用Weste

8、rnBlotting測定NF-κ3 P65亞基磷酸化水平。
　　 6、利用慢病毒為載體，通過慢病毒感染，在HT-29細(xì)胞中單獨或共過表達TLR-4和MD-2蛋白后，分別加入LPS和AOG，用ELISA試劑盒測定上清中的TNF-α的含量，用Western Blotting測定NF-κB P65亞基磷酸化水平7、用TLR-4/MD-2/ NF-κB-luciferase熒光素酶報告系統(tǒng)檢測TLR-4突變體、MD-2突變體檢測LPS和

9、AOG誘導(dǎo)的TLR-4/MD-2/NF-κB-luciferase信號通路的影響;
　　 8、用TLR-4/MD-2/NF-κB-luciferase熒光素酶報告系統(tǒng)檢測MD-2 K122R突變體對LPS和AOG共同誘導(dǎo)的TLR-4/MD-2/NF-κB-1uciferase信號通路的影響;
　　 9、用免疫共沉淀法檢測MD-2 K122R突變體對TLR-4和MD-2復(fù)合體形成的影響。
　　 結(jié)果：
　　

10、 1、AOG單獨使用可誘導(dǎo)TNF-α釋放、激活HT-29細(xì)胞的NF-κ3信號通路;而和LPS聯(lián)合使用則會抑制抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α的釋放及NF-κB信號通路，競爭性地抑制LPS引起的NF-κB活化;
　　 2、AOG單獨使用可促進HT-29細(xì)胞的TLR-4蛋白在細(xì)胞膜上的表達，與LPS聯(lián)合應(yīng)用則抑制其引起的TLR-4在膜的表達;
　　 3、AOG激活NF-κB信號通路依賴TLR-4、MD-2蛋白，敲除TLR-4和MD

11、-2蛋白表達能抑制AOG對NF-κB信號通路的激活;
　　 4、TLR-4突變體TLR-4 R264A對LPS和AOG激活NF-κB信號通路都沒有明顯的影響;而突變體K341R和K362R大大降低了LPS和AOG對NF-κB信號通路的激活，但相對于AOG而言其對LPS的影響較大;
　　 5、MD-2突變體K58R明顯減低了LPS和AOG對NF-κB信號通路的激活。突變體S118A對LPS和AOG激活NF-κB信號通路的影

12、響不大;而突變體K122R不影響LPS對信號通路的激活，而基本完全抑制了AOG的激活作用;
　　 6、通過TLR-4和MD-2突變體對LPS及AOG誘導(dǎo)的NF-κB信號通路的影響可以看出，雖然LPS和AOG對NF-κB信號通路的激活均依賴于TLR-4和MD-2蛋白，可能均需要形成LPS/TLR-4/MD-2以及AOG/TLR-4/MD-2復(fù)合體，但LPS和AOG與TLR-4、MD-2的結(jié)合位點明顯不同;
　　 7、LPS

13、和AOG單獨使用均能激活NF-κB信號通路，而聯(lián)合使用則抑制NF-κB信號通路。
　　 結(jié)論：
　　 AOG激活NF-κB信號通路依賴TLR-4、MD-2蛋白，敲除TLR-4和MD-2蛋白表達能抑制AOG對NF-κB信號通路的激活，推測AOG激活NF-κB和LPS類似，需要形成AOG/TLR-4/MD-2復(fù)合體。TLR-4的341和362位賴氨酸對LPS/TLR-4/MD-2以及AOG/TLR-4/MD-2形成的復(fù)合體均

14、有很大影響，對LPS/TLR-4/MD-2復(fù)合體影響更大。MD-2122賴氨酸突變成精氨酸對AOG激活NF-κ3信號通路更為重要，可能是AOG、TLR-4和MD-2形成的復(fù)合體中的關(guān)鍵氨基酸。LPS和AOG單獨使用均能激活NF-κB信號通路，而聯(lián)合使用則抑制NF-κB信號通路。LPS和AOG和TLR-4、MD-2的結(jié)合位點明顯不同，我們推測LPS和AOG聯(lián)合使用時，可能需要和TLR-4/MD-2形成各自不同構(gòu)象的復(fù)合體，因需要和TLR/