1、論文Ⅰ能量代謝調(diào)節(jié)對高糖誘導(dǎo)的心肌細胞和成纖維細胞的蛋白質(zhì)組學(xué)和分泌組學(xué)研究
　　研究背景
　　目前的統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，世界糖尿病患者約1.8億，而到2025年該數(shù)字將增至3.0億。糖尿病是心力衰竭的獨立危險因素，既往的研究表明正常人心力衰竭的發(fā)病率是1％-4％，但是糖尿病患者心衰的發(fā)病率可達到12％。糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy, DCM)是糖尿病代謝異常所引起的特異性心肌病，主要特點為左室擴大

2、和室壁運動減弱，早期主要表現(xiàn)是舒張功能低下，而晚期則表現(xiàn)為收縮功能異常。DCM是糖尿病患者的主要心血管并發(fā)癥之一，也是糖尿病患者心血管疾病的高發(fā)病率和病死率的重要原因。DCM的病因主要包括高血糖、氧化應(yīng)激、心臟自主神經(jīng)病變和胰島素抵抗等，而高血糖在心肌細胞代謝紊亂中起到了重要的作用。
　　DCM的主要病理變化包括心肌間質(zhì)纖維化，心肌細胞凋亡和心肌細胞自噬。心肌間質(zhì)纖維化是成纖維細胞分泌的膠原在心肌間質(zhì)的過度沉積，進而導(dǎo)致了心臟松弛

3、性的降低和僵硬度的提高，進而影響心功能。心肌細胞凋亡是細胞的一種程序性死亡，是DCM心肌細胞丟失的主要原因。高糖狀態(tài)可以引起細胞代謝紊亂，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體受損，從而導(dǎo)致細胞凋亡，由于心肌是不可增殖的永久細胞，所以心肌凋亡可導(dǎo)致心肌收縮能力的減低。自噬是調(diào)節(jié)細胞內(nèi)大分子和細胞器降解和循環(huán)利用的主要代謝通路，自噬功能受損將引起錯誤折疊蛋白和破損細胞器的積聚，導(dǎo)致細胞死亡。
　　正常成人的心臟代謝主要來自兩部分:60％～70％的脂肪酸β氧

4、化和20％～25％的葡萄糖氧化。研究證實，在糖尿病狀態(tài)下，脂肪酸β氧化和葡萄糖氧化的比例將拉大，脂肪酸β氧化顯著上升而葡萄糖氧化進一步降低。脂肪酸氧化可產(chǎn)生大量脂質(zhì)中間體，其累積在心肌細胞中最終導(dǎo)致心功能受損。脂肪酸還損傷心肌細胞的鈣離子調(diào)節(jié)，導(dǎo)致心肌收縮功能受損;而且脂肪酸氧化會增加活性氧的產(chǎn)生，過多的脂肪酸氧化將引起活性氧的積聚，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，從而對心肌細胞產(chǎn)生損害。研究證實恢復(fù)代謝的正常比例可恢復(fù)心功能，但是具體的作用機制不明，其

5、是否可調(diào)節(jié)心肌細胞凋亡、心肌細胞自噬和心肌間質(zhì)纖維化還有待探討。
　　在本實驗中，我們將運用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，給予代謝調(diào)節(jié)劑曲美他嗪(Trimetazidine，TMZ)，研究能量代謝轉(zhuǎn)變對于高糖誘導(dǎo)下心肌細胞的蛋白作用，以及對高糖誘導(dǎo)下心肌細胞和心肌成纖維細胞分泌蛋白的作用，探討能量代謝轉(zhuǎn)變后差異蛋白與心肌細胞凋亡和自噬的相關(guān)性，以及和成纖維細胞膠原分泌的關(guān)系，并分析其可能機制，為進一步的實驗提供理論基礎(chǔ)。
　　研究目的

6、r>　　1.探討能量代謝轉(zhuǎn)變對高糖誘導(dǎo)下心肌細胞和成纖維細胞分泌蛋白及心肌細胞蛋白的作用;
　　2.探討能量代謝轉(zhuǎn)變后三種不同來源的差異蛋白與能量代謝、心肌凋亡、心肌自噬和心肌間質(zhì)纖維化的關(guān)系，為后續(xù)實驗提供基礎(chǔ);
　　3.探討能量代謝轉(zhuǎn)變后三種不同來源的差異蛋白與心肌細胞凋亡、心肌細胞自噬和心肌間質(zhì)纖維化關(guān)鍵調(diào)節(jié)通路的關(guān)系，為后續(xù)實驗提供基礎(chǔ)。
　　研究方法
　　1.實驗?zāi)Ｐ偷慕?br>　　本研究以原代培養(yǎng)的

7、新生大鼠心肌細胞(Neonatal rat ventricular myocytes，NRVM)、H9c2大鼠心肌細胞系和原代培養(yǎng)的新生小鼠心肌成纖維細胞(Cardiacfibroblasts，CF)為研究對象，分成對照組、高糖組和TMZ干預(yù)組3組，對照組給予低糖(5.5mmol/L)+甘露醇(27.5mmol/L)刺激，高糖組給予葡萄糖(33mmol/L)刺激，TMZ干預(yù)組給予TMZ(10μmol/L)+高糖(33mmol/L)刺激，

8、分別孵育三種細胞，進而收集H9c2細胞、NRVM培養(yǎng)基和CF培養(yǎng)基。
　　2.蛋白的收集
　　無血清培養(yǎng)基中，高糖刺激NRVM和CF24h，收取上清，濃縮離心管離心，為下一步樣品處理做準(zhǔn)備。高糖刺激H9c2細胞24h，PBS沖洗后，刮取細胞，多次離心去除血清影響。
　　3.樣品處理，質(zhì)譜及數(shù)據(jù)分析
　　向收取的細胞中加入細胞裂解液，結(jié)合超聲波破碎細胞，應(yīng)用Bradford蛋白質(zhì)定量法測定蛋白質(zhì)濃度，隨后經(jīng)過TCE

9、P還原，IDA烷基化，胰酶消化，C18除鹽，Nanodrop測定蛋白濃度，TMT標(biāo)記蛋白肽段或者無標(biāo)記蛋白定量，最后樣品應(yīng)用Q-Exactive質(zhì)譜儀進行分析。使用Proteome Discoverer1.4進行數(shù)據(jù)庫收索;采用GO分類工具對鑒定的蛋白進行分子功能分類與生物進程分類;應(yīng)用Ingenuity Pathways Analysis(IPA)軟件進行通路分析。
　　結(jié)果
　　1.質(zhì)譜分析結(jié)果
　　經(jīng)過ESI-M

10、S/MS鑒定并通過SEQUEST搜索對比，心肌細胞結(jié)果共鑒定出1235種蛋白，對照組與高糖組的差異蛋白為161種，其中123種蛋白發(fā)生上調(diào)，38種蛋白下調(diào);經(jīng)過TMZ干預(yù)后，上調(diào)蛋白中84種蛋白發(fā)生回調(diào)，29種下調(diào)蛋白升高。NRVM培養(yǎng)基共鑒定121種蛋白，高糖組與對照組相比的差異蛋白為26種，其中14種蛋白發(fā)生上調(diào)，12種蛋白下調(diào);經(jīng)過TMZ干預(yù)后，7種上調(diào)蛋白發(fā)生回調(diào)，2種下調(diào)蛋白發(fā)生回調(diào)。CF培養(yǎng)基共鑒定出1415種蛋白，對照組與

11、高糖組的差異蛋白為218種，其中47種蛋白發(fā)生上調(diào)，171種蛋白發(fā)生下調(diào);經(jīng)過TMZ干預(yù)后，其中17種上調(diào)蛋白發(fā)生回調(diào)，163種下調(diào)蛋白發(fā)生回調(diào)。
　　2.TMZ干預(yù)后高糖誘導(dǎo)的大鼠心肌細胞差異蛋白表達譜分析
　　與高糖組相比，按照差異蛋白定位分類，TMZ干預(yù)組差異蛋白主要包括胞漿蛋白(46.9％)，大分子復(fù)合物(14.3％)和細胞器蛋白(26.55％)等;按照蛋白的功能分類，TMZ干預(yù)組的差異蛋白主要包括具有催化活性蛋白(

12、45.3％)，結(jié)合活性蛋白(32.6％)和結(jié)構(gòu)分子活性蛋白(14.0％)等。
　　通過對差異蛋白的分析，差異蛋白中與能量代謝相關(guān)的蛋白主要包括果糖二磷酸醛縮酶(Aldolase A，F(xiàn)ructose-bisphosphate，Aldoa)、6-磷酸葡萄糖脫氫酶(6-phosphogluconate dehydrogenase，G6pd)、細胞色素b-cl復(fù)合體亞基1(Cytochrome b-c1 complex subunit1

13、,mitochondrial,Uqcrc1)等。
　　與凋亡相關(guān)的蛋白主要包括胞漿精氨酸-tRNA連接酶(Arginine--tRNA ligase，cytoplasmic，Rars)、絲氨酸蛋白酶(Serine protease，HTRA1)等。
　　與自噬相關(guān)的蛋白包括泛素樣蛋白激活酶1(Ubiquitin-like modifier-activatingenzyme1,Uba1),Hsp90ab1和Stat1等。

14、>　　與pi3k/AKT通路相關(guān)的蛋白主要包括粘著斑蛋白(Vinculin，Vcl)、解聚蛋白(Destrin，Dstn)、ADP核糖基化因子4(ADP-ribosylation factor4，Arf4)、Arhgdia、Stat1、Gdi2等;與AMPK相關(guān)的蛋白包括三功能性酶亞基α(Trifunctional enzymesubunit alpha，mitochondrial，Hadha)、線粒體延胡索酸酯酶(Fumarate h

15、ydratase，F(xiàn)h)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate aminotransferase，mitochondria，Got2)。
　　3.TMZ干預(yù)后高糖誘導(dǎo)下心肌細胞差異分泌蛋白表達譜分析
　　與對照組相比，根據(jù)差異蛋白參與的生物過程分類，高糖組分泌的差異蛋白主要包括生物調(diào)節(jié)蛋白(5.7％)、細胞成分調(diào)節(jié)蛋白(8.6％)、細胞過程調(diào)節(jié)蛋白(31.4％)、發(fā)育調(diào)節(jié)蛋白(8.6％)、定位調(diào)節(jié)蛋白(8.6％)、代謝調(diào)節(jié)蛋白

16、(22.9％)、多細胞生物過程調(diào)節(jié)蛋白(8.6％)和刺激反應(yīng)蛋白(5.7％);TMZ干預(yù)后，參與生物學(xué)過程的差異蛋白組成轉(zhuǎn)變?yōu)樯镎{(diào)節(jié)蛋白(12.5％)、細胞成分調(diào)節(jié)蛋白(6.3％)、細胞過程調(diào)節(jié)蛋白(25％)、發(fā)育調(diào)節(jié)蛋白(12.5％)、定位調(diào)節(jié)蛋白(6.3％)、代謝調(diào)節(jié)蛋白(25％)、多細胞生物過程調(diào)節(jié)蛋白(6.3％)和刺激反應(yīng)蛋白(6.3％)。
　　與對照組相比，根據(jù)差異蛋白的功能分類，高糖組心肌細胞分泌的差異蛋白包括催化活

17、性蛋白(47.6％)、結(jié)合活性蛋白(28.6％)和結(jié)構(gòu)分子活性蛋白(23.8％);與高糖組相比，TMZ干預(yù)組心肌細胞分泌的差異蛋白包括催化活性蛋白(37.5％)、結(jié)合活性蛋白(37.5％)和結(jié)構(gòu)分子活性蛋白(25％)。
　　經(jīng)過蛋白質(zhì)相互作用分析，與高糖組相比，TMZ干預(yù)組大鼠心肌細胞分泌的差異蛋白和凋亡相關(guān)的蛋白包括膜聯(lián)蛋白A7(annexin A7，Anxa7)和四個半LIM域蛋白2(four and a half LIM d

18、omains protein2，F(xiàn)hl2)等。
　　與pi3k/AKT信號通路相關(guān)的蛋白是解離抑制蛋白(rho GDP-dissociationinhibitor2，Gdi2)。
　　4.TMZ干預(yù)后高糖誘導(dǎo)下成纖維細胞分泌的差異蛋白表達譜分析
　　與對照組相比，根據(jù)差異蛋白的功能分類，高糖組成纖維細胞分泌的差異蛋白包括細胞結(jié)合活性蛋白(39.70％)、受體活性蛋白(5.80％)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性蛋白(3.30％)、抗氧化

19、活性蛋白(0.80％)和轉(zhuǎn)運活性蛋白(5.80％);與高糖組相比，TMZ干預(yù)組的差異蛋白包括結(jié)合活性蛋白(38.80％)、受體活性蛋白(7.10％)、結(jié)構(gòu)分子活性蛋白(4.30％)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性蛋白(4.10％)、催化活性蛋白(38.80％)、抗氧化活性蛋白(1.00％)和轉(zhuǎn)運活性蛋白(5.10％)。
　　與對照組相比，根據(jù)差異蛋白參與的生物學(xué)過程分類，高糖誘導(dǎo)組成纖維細胞分泌的差異蛋白包括生物調(diào)節(jié)蛋白(4.90％)、定位調(diào)節(jié)蛋白

20、(5.30％)、復(fù)制調(diào)節(jié)蛋白(1.50％)、多細胞生物過程調(diào)節(jié)蛋白(5.8％)、刺激反應(yīng)蛋白(6.00％)、生物附著調(diào)節(jié)蛋白(6.00％)、多細胞組分或合成調(diào)節(jié)蛋白(6.40％)、免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白(6.80％)、發(fā)育調(diào)節(jié)蛋白(7.90％)、代謝相關(guān)蛋白(20.00％)和細胞過程調(diào)節(jié)蛋白(29.40％); TMZ干預(yù)后，與高糖組相比，成纖維細胞分泌的差異蛋白主要包括生物調(diào)節(jié)蛋白(6.10％)、定位調(diào)節(jié)蛋白(5.70％)、復(fù)制調(diào)節(jié)蛋白(1.

21、90％)、多細胞組分或合成調(diào)節(jié)蛋白(5.70％)、刺激反應(yīng)蛋白(7.10％)、生物附著調(diào)節(jié)蛋白(5.20％)、多細胞生物過程調(diào)節(jié)蛋白(6.10％)、免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白(5.20％)、發(fā)育調(diào)節(jié)蛋白(8.00％)，代謝調(diào)節(jié)蛋白(19.80％)和細胞過程調(diào)節(jié)蛋白(29.20％)。
　　經(jīng)過蛋白質(zhì)相互作用分析，TMZ干預(yù)組分泌的差異蛋白和能量代謝相關(guān)的蛋白包括肌酸激酶(creatine kinase，mitochondrial2，Ckmt2

22、)、染色體-解旋-DNA-結(jié)合蛋白7(Chromodomain-helicase-DNA-binding protein7，Chd7)和Aldoa等
　　與凋亡相關(guān)的蛋白包括基因絲動力重鏈蛋白8(axonemal dynein heavy chain8，Dnahc8)、Traf1和Sox5等。
　　與自噬相關(guān)的蛋白關(guān)包括Dapk1和Zc3h12d，而與mTOR相關(guān)的包括Dnahc8和Smad5。
　　與膠原分泌相關(guān)的蛋

23、白包括非肌肉α-肌動蛋白(non-muscle alpha-actinin4，Actn4)和p58/GTA蛋白激酶(p58/GTA protein kinase，Cdk11b)等
　　經(jīng)過相互作用分析，核苷二磷酸激酶(Nucleoside diphosphate kinase，Gm20390)以及Ppard與AMPK信號通路存在相互作用關(guān)系;與pi3K/AKT信號通路相關(guān)是磷酯酶Cβ1(phospholipase C beta1，

24、Plcb1)和肌微管素同源蛋白2(myotubularin homologous protein2，Mtmr2)等;與AKT信號通路存在相互關(guān)系的蛋白為Fanconi貧血蛋白(Fanconi anemia protein，F(xiàn)anca)和結(jié)締組織生長因子(Connective tissue growth factor, Ctgf)等。
　　經(jīng)過蛋白相互作用分析，與MAPK存在相互作用的蛋白包括Smad5、Mapkapk5、parp1

25、、Traf1、Ppard、Dapk1、Plcb1、Grik2、Dnahc8和Kcnh8。
　　5.TMZ干預(yù)對高糖誘導(dǎo)下心肌細胞中炎癥相關(guān)蛋白的影響
　　經(jīng)過IPA軟件進行分析，與高糖組相比，TMZ干預(yù)組中有18種差異蛋白與炎癥相關(guān)，其中包括膜聯(lián)蛋白A3(Annexin A3)、腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Adeninephosphoribosyltransferase，APRTase)、RNA解螺旋酶p68(DEAD(Asp-G

26、lu-Ala-Asp)和細絲蛋白A(Filamin alpha，F(xiàn)LNA)等。
　　6.TMZ干預(yù)對高糖誘導(dǎo)下心肌細胞中ROS相關(guān)蛋白的影響
　　經(jīng)過IPA軟件進行分析，與高糖組相比，TMZ干預(yù)組中有12種差異蛋白涉及氧化應(yīng)激的調(diào)控過程，其中包括G6PD、硫氧還蛋白(Thioredoxin)、17β-羥基類固醇脫氫酶(17-β-Hydroxysteroid dehydrogenase，HSD10)、熱休克蛋白90β(Heat

27、shock protein HSP90-beta，HSP90beta)和硫氧還蛋白依賴性過氧化物還原酶(Peroxiredoxin3,PRX3)等。
　　7.TMZ干預(yù)對高糖誘導(dǎo)下心肌細胞中與心肌肥厚相關(guān)調(diào)控蛋白的影響
　　經(jīng)過IPA軟件進行分析，與高糖組相比，TMZ干預(yù)組中有9種差異蛋白與心肌肥厚的調(diào)控過程相關(guān)，其中包括腺苷酸環(huán)化酶相關(guān)蛋白1(Adenylyl cyclase-associated protein1，CAP

28、1)、二氫嘧啶相關(guān)蛋白3(Dihydropyrimidinase-related p-rotein3，DPYL3)、溶酶體膜蛋白2(Lysosome membrane protein2，LIMP-2)和膜突蛋白(Moesin)等。
　　結(jié)論
　　1.能量代謝調(diào)節(jié)后，高糖誘導(dǎo)下的心肌細胞中有84種差異蛋白發(fā)生回調(diào);高糖誘導(dǎo)下心肌細胞分泌的差異蛋白中有26種發(fā)生回調(diào);高糖誘導(dǎo)下心肌成纖維細胞分泌的差異蛋白中有218種發(fā)生回調(diào)，提

29、示能量代謝調(diào)節(jié)對高糖刺激的干預(yù)十分廣泛;
　　2.回調(diào)的差異蛋白與代謝、心肌凋亡、心肌自噬和心肌成纖維分泌膠原密切相關(guān)，提示代謝改變可能在高糖條件下調(diào)節(jié)以上過程，為進一步研究提供了基礎(chǔ);
　　3.回調(diào)的差異蛋白與代謝相關(guān)通路PI3K/AKT、纖維化相關(guān)通路MAPKs以及凋亡和自噬關(guān)鍵通路AMPK密切相關(guān)，提示代謝調(diào)節(jié)可能通過上述信號通路對心肌細胞和心肌成纖維細胞發(fā)揮作用。
　　關(guān)鍵詞:能量代謝調(diào)節(jié);蛋白質(zhì)組學(xué);心肌細胞

30、;心肌成纖維細胞;高糖
　　論文Ⅱ早期優(yōu)化能量代謝在2型糖尿病大鼠糖尿病心肌病中的作用
　　研究背景
　　隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展以及生活水平的日益提高，人們不健康的生活方式以及飲食習(xí)慣成為糖尿病發(fā)病的主要誘因。據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，2025年全球糖尿病人口預(yù)計將增加至3億，糖尿病已經(jīng)成為威脅全球人類健康的最重要的非傳染性疾病之一，其造成的社會經(jīng)濟負擔(dān)以及對人類健康的影響是世界范圍共同面臨的嚴峻問題，約有一半的糖尿病患者

31、死于心血管并發(fā)癥。糖尿病心肌病(Diabetic Cardiomyopathy, DCM)是糖尿病患者發(fā)生心力衰竭和猝死的主要原因，其主要表現(xiàn)為早期無癥狀的舒張功能受損，進而表現(xiàn)為收縮功能受損，最終發(fā)展為有癥狀的充血性心力衰竭。由于目前糖尿病心肌病患者的不斷增加，繼續(xù)探尋DCM的有效治療藥物具有重要意義。
　　糖尿病心肌病(DCM)作為一種代謝性心肌病，其發(fā)病不依賴于冠心病、高血壓、瓣膜病以及其他可以導(dǎo)致心功能障礙的心臟疾病。目前

32、DCM的藥物治療主要包括磺脲類、二甲雙胍、噻唑烷二酮類(Thiazolidinediones，TZDs)、胰島素、二肽基肽酶Ⅳ(Dipeptidyl peptidas.e-4，DPP-4)抑制劑、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（Renin-angiotensin-aldosterone System，RAAS）抑制劑、血管緊張素受體阻斷劑（Angiotensin Receptor Blockers，ARBs）和β受體阻滯劑，但是相關(guān)回顧性

33、研究表明，很多類型的糖尿病治療藥物，如磺脲類、TZDs和胰島素等在改善心衰方面均無明顯作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)強化血糖治療方法對于DCM的死亡率也無任何影響。流行病學(xué)研究表明DCM的發(fā)病率仍在不斷增加，提示目前針對DCM的治療方法效果不佳。DCM的發(fā)病存在亞臨床階段，因此DCM的診斷極易被忽視以及延誤，針對DCM的預(yù)防顯得尤為重要。以上的研究表明亟需一種新的針對DCM的預(yù)防和治療的方法。
　　糖尿病相關(guān)的心臟能量代謝紊亂在DCM的發(fā)病

34、過程中起到了重要作用，其特點為脂肪酸β氧化增加和糖代謝減少。既往的研究證實脂肪酸β氧化可增加自由基的產(chǎn)生，其進一步的積聚引起氧化應(yīng)激，從而導(dǎo)致DCM的發(fā)生發(fā)展。過度的脂肪酸代謝還可降低跨肌漿網(wǎng)鈣離子流，損傷心肌收縮，進而影響心功能;過度的脂肪酸代謝還可抑制糖的利用，進一步損傷糖代謝。研究表明心肌代謝底物的改變遠早于DCM的發(fā)生，提示代謝底物可能是DCM的啟動因素?；谝陨涎芯?，恢復(fù)脂肪酸β氧化和糖代謝的正常比例，可能開辟出DCM治療的新

35、方向。DCM的主要發(fā)病機制包括心肌間質(zhì)纖維化，心肌細胞凋亡和心肌細胞自噬。心肌間質(zhì)纖維化是細胞外基質(zhì)在心肌間質(zhì)的過度沉積，進而導(dǎo)致了心臟松弛性的降低和僵硬度的提高，進而影響心功能。心肌細胞的凋亡是細胞的程序性死亡，研究表明在糖尿病狀態(tài)下，心肌細胞的凋亡比非糖尿病狀態(tài)增加85倍，由于心肌細胞不可增殖，心肌細胞數(shù)目的減少將導(dǎo)致有效收縮單位減少，進一步影響心功能。自噬為細胞內(nèi)降解及循環(huán)利用蛋白、脂質(zhì)及細胞器等的機制，自噬功能紊亂可影響心肌功能

36、，從而也可影響心功能。我們第一部分蛋白質(zhì)組學(xué)的研究結(jié)果表明代謝調(diào)節(jié)可對心肌成纖維細胞的分泌蛋白、心肌細胞的蛋白及其分泌蛋白的表達水平產(chǎn)生重大影響，而這些差異蛋白的表達與心肌細胞凋亡、心肌細胞自噬和心肌間質(zhì)纖維化密切相關(guān)，提示我們代謝調(diào)節(jié)可能通過對此三個過程產(chǎn)生作用，從而調(diào)控DCM的發(fā)展。
　　綜上所述，我們提出如下假說:早期促進脂肪酸β氧化向葡萄糖氧化的轉(zhuǎn)變，可以部分預(yù)防DCM，機制主要可能是通過調(diào)節(jié)心肌細胞凋亡、心肌細胞自噬和心

37、肌間質(zhì)纖維化來實現(xiàn)的。在本實驗中，我們建立了2型糖尿病大鼠模型并給予代謝調(diào)節(jié)劑曲美他嗪干預(yù)，旨在探討早期代謝底物轉(zhuǎn)變對DCM的作用。
　　研究目的
　　1.建立2型糖尿病大鼠的DCM模型，研究心臟脂肪酸氧化向葡萄糖氧化的轉(zhuǎn)變對DCM的作用;
　　2.探討能量代謝調(diào)節(jié)在DCM大鼠模型中對心臟結(jié)構(gòu)以及心功能情況的影響;
　　3.研究能量代謝調(diào)節(jié)在DCM大鼠模型中對心肌間質(zhì)纖維化、心肌細胞凋亡和自噬的作用;探討其是否通

38、過PI3K/AKT、MAPKs及AMPK/Bcl-2-Beclin1信號通路發(fā)揮心臟保護作用。
　　研究方法
　　1.2型糖尿病大鼠動物模型的建立
　　18只體重120g-140g的雄性SD大鼠（約5周齡），適應(yīng)性喂養(yǎng)（普通飼料和水）1周后將其隨機分為2組，對照組(Control組，n=6)和糖尿病組(DM組，n=12)，對SD大鼠行基礎(chǔ)水平胰島素耐量檢測(IPITT)和空腹葡萄糖耐量檢測(IPGTT)。Control

39、組大鼠喂以基礎(chǔ)飼料，DM組大鼠喂以高糖高脂高熱量飼料。4周后再次行IPITT和IPGTT，將DM組出現(xiàn)胰島素抵抗(Insulin resistance，IR)的大鼠一次性給予腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ，27.5mg/kg)。各組大鼠繼續(xù)喂養(yǎng)原飼料1周，隨后檢測DM組大鼠的空腹血糖(FBG)及空腹胰島素(FINS)水平，并計算胰島素敏感指數(shù)(ISI)(公式In[(FINSxFBG)-1])。將連續(xù)2次空腹血糖≥11.1 mmol/L的大鼠

40、納入實驗。隨后將DM組隨機分為2個亞組:DM組(n=6)和DM+TMZ組(n=6)，TMZ(30mg/kg/day)灌胃8周后，處死大鼠，留取標(biāo)本。
　　2.腹腔葡萄糖耐量實驗(IPGTT)及胰島素耐量實驗(IPITT)
　　IPGTT:大鼠禁食12h后經(jīng)尾靜脈取血測定血糖，隨后經(jīng)腹腔注射葡萄糖(1g/kg)，分別在注射葡萄糖15min，30min，60min，120min后，于尾靜脈取血，使用強生穩(wěn)步血糖儀監(jiān)測血糖變化，并

41、通過血糖結(jié)果計算血糖曲線下面積(AUC)。
　　IPITT:大鼠禁食4h后經(jīng)尾靜脈取血測定血糖，隨后經(jīng)腹腔注射胰島素(1unit/kg)，血糖測定時間點、測定方法以及AUC的計算同IPGTT。
　　3.血液學(xué)指標(biāo)檢測
　　于實驗0周、4周、5周、13周時取血進行血液生化分析。大鼠取血前禁食12h，然后于頸靜脈竇處取血1ml，離心分離血清后，運用Bayerl650血生化分析儀檢測血糖(FBG)、總膽固醇(TC)及甘油三酯

42、(TG)。運用酶聯(lián)免疫法測定空腹胰島素水平(FINS)。
　　4.血壓和心率監(jiān)測
　　使用無創(chuàng)大鼠尾動脈血壓測量儀測量大鼠收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、平均動脈壓(MAP)以及心率(HR)，每只大鼠測量3次，取平均值。
　　5.心導(dǎo)管檢測
　　戊巴比妥鈉(2.5％)麻醉下，行心導(dǎo)管檢測。開胸后將導(dǎo)管從左心室心尖處插入，記錄左室舒張末壓(LVEDP)和收縮壓(LVSP)。
　　6.留取組織學(xué)標(biāo)本

43、　　將大鼠心臟取出，其中一部分放入多聚甲醛(4％)中，固定1-2周后，石蠟包埋，切為4.5um厚的組織切片。另一部分左室心肌組織凍于-80℃冰箱中，以備Western blotting使用。
　　7.組織和形態(tài)學(xué)分析
　　石蠟切片進行H&E染色，Masson染色和天狼星紅染色，分別顯示心臟的大體形態(tài)和纖維化程度。
　　8.心肌細胞調(diào)亡的檢測
　　TUNEL法檢測左室心肌細胞的調(diào)亡水平。
　　9.免疫組織化學(xué)

44、染色
　　石蠟切片滴加兔抗大鼠CollagenⅠ和CollagenⅢ—抗，4℃過夜后，滴加山羊抗兔二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。結(jié)果顯示心肌組織CollagenⅠ、Ⅲ的分布和表達水平。圖片處理與分析采用Image-Pro Plus5.0軟件。
　　10.Western blotting實驗
　　提取大鼠左室心肌組蛋白，測定濃度，應(yīng)用Western blotting檢測其中p-AMPK, t-AMPK, Caspase3

45、,PARP, p-ERK, t-ERK, p-P38, t-P38, p-JNK, t-JNK,p-PI3 K, t-PI3K，p-AKT, t-AKT, ATG5和ATG7的蛋白表達水平
　　13.統(tǒng)計分析
　　計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示。采用獨立樣本t檢驗比較兩組間的差異，采用one-way ANOVA比較多組間的均數(shù)。所有的統(tǒng)計過程均通過統(tǒng)計軟件SPSS16.0完成，以p＜0.05作為差異有統(tǒng)計學(xué)意

46、義。
　　結(jié)果
　　1.TMZ改善2型糖尿病大鼠的代謝紊亂
　　實驗結(jié)果顯示:FBG及FINS在4周時開始升高，TG在5周時開始升高，實驗?zāi)〥M組TC、TG、FBG和FINS明顯升高。給予TMZ干預(yù)后，與DM組相比，DM+TMZ組TC、TG、FBG及FINS均明顯降低(p＜0.05)。
　　2.TMZ改善DCM大鼠葡萄糖耐量和胰島素敏感性
　　高脂喂養(yǎng)4周后，行IPGTT及IPITT檢測。IPGTT結(jié)果顯示

47、，與基線水平相比，DM組大鼠0min和30min時的血糖水平明顯升高(p＜0.05)，曲線下面積(AUC)明顯增加(p＜0.05)。IPITT結(jié)果顯示各個時間點的血糖水平均較基線水平明顯升高(p＜0.05)，AUC也明顯增加(p＜0.05);實驗?zāi)?，與DM組大鼠相比，DM+TMZ組的IPGTT和IPITT結(jié)果表明該組大鼠的血糖水平及AUC均明顯降低(p＜0.05)，顯示TMZ干預(yù)可以提高糖尿病大鼠葡萄糖耐量以及增加胰島素敏感性。

48、　　3.TMZ改善DCM大鼠的左室重構(gòu)
　　DM組大鼠心臟較Control組心臟明顯增大，心臟重量/體重(HW/BW)明顯提高（3.39±0.07 vs.2.51±0.05，p＜0.05），HE染色顯示左室室壁增厚，肌纖維排列紊亂，間隙疏松，并可見肌纖維斷裂;給予TMZ治療后，DM+TMZ組大鼠較DM組大鼠心臟稍微變小，HW/BW明顯減小（2.88±0.09 vs.3.39±0.07，P＜0.05），室壁變薄，肌纖維排列相對致密且

49、有序。
　　4.TMZ改善DCM大鼠的心肌間質(zhì)纖維化
　　Masson染色及天狼猩紅染色顯示DM組較Control組肌纖維排列疏松，間質(zhì)和血管周圍存在大量染為藍綠色的膠原纖維，左室心肌組織膠原容積分數(shù)(CVF％)和血管周圍纖維化指數(shù)（PVCA/LA）明顯增加(p＜0.05)。給予TMZ治療后，與DM組相比，DM+TMZ組肌纖維排列較致密，間質(zhì)和血管周圍存在的膠原纖維明顯減少，CVF％和(PVCA/LA)明顯下降(p＜0.05

50、)。
　　免疫組化半定量結(jié)果顯示相對于Control組，DM組心肌組織膠原Ⅰ/Ⅲ的表達明顯增加(p＜0.05)，而給予TMZ治療后，心肌組織膠原Ⅰ/Ⅲ的表達明顯降低。
　　5.TMZ抑制DCM大鼠的心肌細胞凋亡
　　Tunel染色顯示DM組較Control組的心肌細胞Tunel陽性細胞明顯增加(p＜0.05)，Western結(jié)果顯示cleaved Caspase和Parp的表達同樣顯著增加(p＜0.05)。給予TMZ治

51、療后，Tunel陽性細胞顯著降低(p＜0.05)，而cleavedCaspase和Parp的表達也顯著降低(p＜0.05)。
　　6.TMZ提高DCM大鼠的心肌細胞的自噬功能
　　Western結(jié)果顯示DM組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值與Control組相比明顯降低(p＜0.05)，并且ATG5和ATG7表達明顯降低(p＜0.05);給予TMZ治療后，DM+TMZ組較DM組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值明顯增加，ATG5和AT

52、G7表達明顯升高(p＜0.05)。
　　7.TMZ改善了DCM大鼠心功能
　　實驗?zāi)?，有?chuàng)心導(dǎo)管法的結(jié)果表明，DM組較Control組的舒張末期左室內(nèi)壓力增加，收縮壓降低(p＜0.05);給予TMZ治療之后，DM+TMZ組較DM組舒張末期左室內(nèi)壓力明顯下降(p＜0.05)，該實驗結(jié)果表明TMZ可以有效改善DCM大鼠的左室舒張功能。
　　8.TMZ對于PI3K/AKT, MAPKs和AMPK/Beclin1-Bcl2信號

53、通路的調(diào)節(jié)
　　Western結(jié)果表明，與Control組相比，DM組PI3 K/AKT通路中的p-PI3K和p-AKT蛋白水平明顯降低(p＜0.05)，MAPK通路中的p-ERK、p-P38和p-JNK蛋白水平明顯增加(p＜0.05)，通路中的p-AMPK蛋白水平明顯降低(p＜0.05)，Beclin1-Bcl2的結(jié)合明顯增加(p＜0.05)。給予TMZ治療后，DM+TMZ組較DM組p-PI3K和p-AKT水平明顯升高(p＜0.

54、05)，p-ERK、和p-P38蛋白水平明顯增加而p-JNK無明顯改變，p-AMPK蛋白水平明顯降低(p＜0.05)，Beclin1-Bcl2的結(jié)合明顯增加(p＜0.05)。
　　結(jié)論
　　1.早期代謝調(diào)節(jié)可部分預(yù)防DCM的發(fā)生和發(fā)展;
　　2.早期代謝調(diào)節(jié)可以通過減輕2型糖尿病大鼠的心肌間質(zhì)纖維化、心肌細胞凋亡以及增強心肌細胞自噬，改善DCM的心室重構(gòu);
　　3.早期代謝調(diào)節(jié)通過激活PI3 K/AKT改善胰島素