1、背景：
　　椎間盤退變(Intervertebral disc degeneration，IVDD)引起的慢性腰痛(low backpain，LBP)是中老年人群最為常見的病癥之一。每年與慢性腰痛相關(guān)的醫(yī)療費用及社會、經(jīng)濟投入巨大，并且隨著老齡化社會的到來，這些支出和投入還將繼續(xù)增加。目前針對于IVDD的病理機制研究非常廣泛，研究顯示年齡、基因、營養(yǎng)、代謝、感染、生物力學(xué)等諸多因素都其發(fā)病相關(guān)。然而，IVDD的確切病因仍不甚明了。

2、
　　椎間盤退變性疾病是椎間盤退變過程進展及惡化的必然結(jié)果。在IVDD的過程中，髓核細胞因凋亡出現(xiàn)數(shù)量減少、表型異常。有研究指出髓核細胞的凋亡是IVDD的啟動因素之一。另外，包括IL-1β和TNF-α在內(nèi)的炎癥因子在退變的椎間盤內(nèi)有顯著的升高。通過一系列信號網(wǎng)絡(luò)，炎癥因子可以導(dǎo)致髓核細胞的凋亡、加速IVDD的進程。然而，髓核細胞凋亡的機制目前仍需進一步的探索。
　　許多基因在IVDD過程中發(fā)揮了重要的作用，包括Caveoli

3、n-1（又稱小窩蛋白-1、窖蛋白-1）。細胞膜向內(nèi)凹陷形成囊狀結(jié)構(gòu)脂筏(Caveolea)，Caveolin-1是其標志蛋白，可表達于多種組織，對脂質(zhì)轉(zhuǎn)運、胞膜運輸和細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路等都具有調(diào)節(jié)作用。Heathfield等的研究首次證實Caveolin-1在人類髓核細胞的表達。最期研究顯示Caveolin-1是IVDD的關(guān)鍵因素之一。退變椎間盤的髓核細胞高水平表達Caveolin-1，與細胞的壞死有相關(guān)性。另外，在支氣管表皮細胞、血管

4、平滑肌細胞以及人白血病細胞系HL-60的研究中已經(jīng)證實了Caveolin-1對于細胞凋亡的調(diào)控作用。然而，關(guān)于Caveolin-1與髓核細胞凋亡的研究目前仍很有限。
　　在軟骨細胞和HepG2細胞的研究中，Caveolin-1能夠通過激活Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控其下游的基因表達。在IVDD的早期，Wnt/β-catenin信號通路活性升高。相關(guān)研究顯示W(wǎng)nt/β-catenin信號通路在IVDD進程發(fā)揮了重要作用。那

5、么，Caveolin-1是否可以通過激活Wnt/β-catenin信號通路在IVDD進程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用？本研究將對Caveolin-1在IVDD中的作用做出進一步的研究，對Caveolin-1和Wnt/β-catenin信號通路在髓核細胞凋亡中的相互聯(lián)系進行分析探討。
　　目的：
　　1.研究Caveolin-1在髓核細胞內(nèi)的表達情況，在炎癥誘導(dǎo)的髓核細胞凋亡過程中的作用。
　　2.Wnt/β-catenin信號

6、通路在炎癥誘導(dǎo)的髓核細胞凋亡過程中發(fā)揮的作用。
　　3.Caveolin-1和Wnt/β-catenin信號通路在炎癥誘導(dǎo)的髓核細胞凋亡過程中的相互作用聯(lián)系及作用機制。
　　方法：
　　為研究炎癥因子對Caveolin-1在髓核細胞內(nèi)表達的作用，培養(yǎng)的髓核細胞分別進行IL-1β(10ng/ml)或TNF-α(50ng/ml)的處理。經(jīng)過0、1、6、12、24、48小時后，分別應(yīng)用Western blotting和Rea

7、l time RT-PCR技術(shù)對髓核細胞內(nèi)Caveolin-1的蛋白水平和mRNA水平進行檢測。
　　為研究Caveolin-1對髓核細胞凋亡的作用，培養(yǎng)的髓核細胞進行炎癥因子的處理，應(yīng)用siRNA技術(shù)下調(diào)髓核細胞內(nèi)Caveolin-1的表達。FITC-AnnexinV/PI熒光染色各處理組的髓核細胞后，流式細胞術(shù)分別對各個處理組的凋亡率進行量化檢測。
　　為研究炎癥因子對髓核細胞內(nèi)Wnt/β-catenin信號通路的作用，

8、培養(yǎng)的髓核細胞如上述實驗步驟分別進行IL-1β(10ng/ml)或TNF-α(50ng/ml)的處理。經(jīng)過0、6、12、24小時后，分別應(yīng)用Westem blotting和Real time RT-PCR技術(shù)檢測髓核細胞內(nèi)β-catenin的蛋白水平和mRNA水平表達情況。
　　為研究Wnt/β-catenin信號通路對髓核細胞凋亡的作用，應(yīng)用siRNA技術(shù)下調(diào)髓核細胞內(nèi)β-catenin的表達，采用流式細胞術(shù)定量檢測髓核細胞的凋

9、亡率。
　　為研究Caveolin-1和WNT/β-catenin信號通路在髓核細胞凋亡過程中的相互作用，我們分別進行了髓核細胞的Caveolin-1沉默和過表達實驗。分別應(yīng)用流式細胞術(shù)和檢測Caspase-3，8，9活性變化的方法評估髓核細胞的凋亡情況。并且通過β-cateninsi RNA抑制WNT/β-catenin信號通路后，檢測對Caveolin-1的作用的影響。
　　結(jié)果：
　　1.炎癥因子促進髓核細胞內(nèi)C

10、aveolin-1的表達
　　髓核細胞經(jīng)炎癥因子處理后，Caveolin-1在蛋白水平和mRNA的表達水平都出現(xiàn)了明顯的上升。其中髓核細胞內(nèi)Caveolin-1的mRNA的表達在炎癥因子處理12小時后達到高峰，為基線值的4.0倍（IL-1β處理組）和3.3倍（TNF-α處理組）。
　　2.Caveolin-1對炎癥誘導(dǎo)的髓核細胞凋亡的調(diào)控作用
　　經(jīng)過炎癥因子的處理以后，髓核細胞凋亡率出現(xiàn)了顯著的升高，從5.2％（對照

11、組）分別上升到29.3％（IL-1β處理組）和26.2％（TNF-α處理組）。髓核細胞凋亡率的升高能夠被Caveolin-1siRNA抑制。經(jīng)過Caveolin-1 siRNA處理以后髓核細胞的凋亡率分別下降到了16％(IL-1β+Caveolin-1siRNA處理組)和14.9％(TNF-α+ Caveolin-1siRNA處理組)。
　　3.炎癥因子誘導(dǎo)Wnt/β-catenin通路的激活
　　經(jīng)炎癥因子的處理后，髓核細

12、胞內(nèi)β-catenin的表達明顯升高。其中β-cateninmRNA的表達呈現(xiàn)時間依賴的方式升高，24小時以后分別達到基線水平的3.47倍（IL-1β處理組）和2.81倍（TNF-α處理組）。經(jīng)過炎癥因子的處理后TOP Flash轉(zhuǎn)錄活性明顯升高，F(xiàn)OP Flash的轉(zhuǎn)錄活性無改變。
　　4.Wnt/β-catenin信號通路對髓核細胞凋亡的作用
　　β-catenin siRNA組，β-catenin的核內(nèi)轉(zhuǎn)運與IL-1β

13、處理組和TNF-α處理組相比較有明顯的下降。經(jīng)過炎癥因子的處理，髓核細胞凋亡率明顯升高。髓核細胞凋亡率的升高能夠被β-catenin siRNA逆轉(zhuǎn)，凋亡率分別下降到13.8％(IL-1β+β-catenin siRNA處理組)和11.2％(TNF-α+β-catenin siRNA處理組)。
　　5.Caveolin-1和Wnt/β-catenin信號通路在炎癥誘導(dǎo)的髓核細胞凋亡過程中的相互作用
　　經(jīng)過炎癥因子的處理后髓

14、核細胞內(nèi)β-catenin核內(nèi)轉(zhuǎn)運的增加能夠被Caveolin-1siRNA所抑制。炎癥因子處理后髓核細胞Caspase-3，9的活性明顯升高，Caveolin-1siRNA和β-catenin siRNA均能抑制該效應(yīng)。Caveolin-1過表達處理后，β-catenin核內(nèi)轉(zhuǎn)運增加，Caspase-3，9的活性出現(xiàn)明顯的升高，然而該效應(yīng)在β-catenin siRNA處理組被抑制。
　　結(jié)論：
　　我們的研究結(jié)果表明，在