1、目的:
　　Priostin(POSTN)是動物體內(nèi)成骨細胞和成纖維細胞分泌的一種細胞外分泌蛋白,在多種生理及病理狀態(tài)下均會表達,病理狀態(tài)下尤為顯著。急性肺損傷(Acute Lung Injury.ALI)是一種肺組織的系統(tǒng)性炎癥,常見原因有膿毒癥、重癥肺炎及創(chuàng)傷等。治療不當(dāng)或不及時可增加患者急性呼吸窘迫綜合癥(Acute Respiratory Distress Syndrome.ARDS)的發(fā)生率,且此類患者的死亡率較高,目前

2、尚無顯著高效的總體治療策略,因此對于急性肺損傷的研究仍然有很強的必要性。有研究表明血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ.AngⅡ)受體拮抗劑能降低大鼠體內(nèi)POSTN表達水平。本研究通過在大鼠體內(nèi)應(yīng)用AngⅡ受體拮抗劑纈沙坦來降低ALI大鼠肺組織POSTN的表達,來探討纈沙坦是否能夠保護膿毒癥導(dǎo)致的急性肺損傷大鼠的肺臟。
　　方法:
　　1.ALI模型建立及動物分組:體重分布200-320g的45只SPF級S-D大鼠按照隨機

3、數(shù)表法分為空白對照組,脂多糖實驗組(LPS組),纈沙坦低量干預(yù)組(10只)、纈沙坦中劑量干預(yù)組(10只)和纈沙坦高劑量干預(yù)組(10只)。動物稱重后記錄數(shù)據(jù),對照組給予1ml無菌生理鹽水經(jīng)大鼠尾靜脈注入,其余4組按照每公斤體重5mgLPS溶入1ml生理鹽水中經(jīng)大鼠尾靜脈注入,纈沙坦干預(yù)組分別按照每公斤體重40mg、80mg、120mg腹腔注射纈沙坦混懸液。
　　2.標(biāo)本留取:各組大鼠經(jīng)上述處置后正常喂食喂水,模型建立后6h麻醉處死大

4、鼠,取大鼠右肺上葉放在-80℃冰箱中保存,用于實時定量PCR(RT-PCR)來檢測肺組織periostin的表達程度。右肺下葉用于測肺組織干濕重比,用止血鉗夾住主氣管,用磷酸鹽溶液反復(fù)沖洗支氣管及肺泡多次,留取肺泡灌洗液(Bronchoalveolar Lavage Fluid.BALF),BALF離心后留取上清于-20℃冰箱中保存,留作炎癥因子檢測。將左葉肺組織放入中性甲醛溶液中,中性甲醛溶液起到組織固定作用。用HE染色制作組織病理標(biāo)

5、本。從腹主靜脈抽取血液,經(jīng)離心機離心后取上清液置于-80℃冰箱中。用ELISA法檢測炎癥因子IL-6、IL-13、TNF-α在BALF中的含量。
　　3.濕干重比的測量:將取出的大鼠右肺下葉放入烤箱中,烤箱設(shè)置溫度為80℃,持續(xù)烘烤24h后,應(yīng)用微量電子稱稱重并記錄。
　　4.組織病理學(xué)檢測:取出固定完全的肺組織,常規(guī)石蠟包埋,采用HE染色,應(yīng)用電子顯微鏡觀察肺部組織炎癥反應(yīng)的程度。
　　5.實時熒光定量PCR(Rea

6、l-Rime PCR)檢測periostin mRNA在肺組織中的表達
　　Periostin mRNA的表達:首先提取肺組織中的總mRNA,然后根據(jù)RT-PCR試劑盒提供的產(chǎn)品說明書在反應(yīng)體系內(nèi)加入實驗所需的各種試劑。設(shè)定PCR的反應(yīng)條件,進行逆轉(zhuǎn)錄循環(huán),循環(huán)45次后,反應(yīng)體系在72℃繼續(xù)延伸10分鐘。根據(jù)GenBank中大鼠的periostin(基因登錄號NM001108550)及β-actin(基因登錄號NM031144)序

7、列設(shè)計引物。
　　Periostin上游引物為5'-AGGAGCCGTGTTTGAGACCAT-3'
　　下游引物為5'-CGGTGAAAGTGGTTTGCTGTTT-3'
　　β-actin上游引物為5'-TCCTCCCTGGAGAAGAGCTA-3'
　　下游引物為5'-TCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3'。
　　將反應(yīng)結(jié)果采用相對定量的方法在熒光定量儀進行分析。以β-actin基因mRNA

8、的表達為內(nèi)參基因,根據(jù)公式計算相對表達量的差值,即為2-△△Ct,2-△△Ct的意義為實驗組的目的基因的表達相對于對照組的表達倍數(shù)。
　　6.Western Blot方法測量肺組織中periostin蛋白含量:將肺組織取出后在冰面上用組織研磨器進行研磨,研磨完成后,應(yīng)用試劑盒提供的說明書測量肺組織中總蛋白得濃度,統(tǒng)一濃度后,進行電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉,抗體雜交,發(fā)光后凝膠成像,采取圖樣。
　　7.用ELISA法檢測炎癥因子IL-4

9、、IL-13及TNF-α在BALF中的濃度。
　　8.數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析:本研究中實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS18軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析及處理。規(guī)定P＜0.05時,可認為比較各組間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　(一)各組大鼠右下肺葉的濕/干重比值
　　與正常對照組(4.01±1.14)相比,LPS組大鼠肺組織濕/干重比(5.36±0.30)明顯升高,差異顯著,有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05),說明模型的制作是成功的。纈沙坦

10、低(4.91±0.15)、中(4.81±0.10)、高(4.85±0.11)干預(yù)組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)。纈沙坦干預(yù)組與LPS組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。
　　(二)組織病理學(xué)檢測
　　用光學(xué)顯微鏡在高倍鏡下觀察病理切片,可見正常組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰,細胞大小正常,肺泡間隔正常,肺泡腔內(nèi)炎癥細胞的浸潤較少,無肺組織明顯水腫。急性肺損傷組大鼠肺組織可見肺泡間隔明顯消失并呈明顯增厚表現(xiàn),組織可見大量出血點

11、及水腫,肺泡腔內(nèi)可見異常大量炎癥細胞的浸潤。纈沙坦干預(yù)組上述病理改變比LPS組大鼠表現(xiàn)有輕度減少。
　　(三)RT-PCR檢測肺組織PeriostinmRNA的表達水平
　　應(yīng)用相對定量的計算辦法,以β-action為內(nèi)參基因,結(jié)果以LPS組目的基因periostin mRNA的表達相對于內(nèi)參基因的變化倍數(shù)表示。結(jié)果分析,LPS實驗組相對于空白對照組比較,LPS組結(jié)果升高明顯,差異顯著,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;纈沙坦干預(yù)組(低、

12、中、高)與LPS組相對表達量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　(四)肺組織Periostin蛋白Western Blot檢測
　　肺組織Western Blot檢測,根據(jù)凝膠成像分析系統(tǒng)檢測,其相應(yīng)條帶對應(yīng)蛋白含量=(樣品條帶的光密度×面積)/(GAPDH的光密度×面積)。肺組織periostin蛋白含量:相對于對照組,LPS組大鼠肺組織periostin蛋白含量明顯增高(2.48±0.07vs0.74±0.05,p＜0.05);相

13、對于對照組,纈沙坦干預(yù)組大鼠肺組織periostin蛋白含量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(1.43±0.03vs0.74±0.05、1.65±0.07vs0.74±0.05、1.48±0.04vs0.74±0.05,p＜0.05),纈沙坦低、中、高劑量干預(yù)組組間比較,periostin蛋白含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(1.43±0.03vs1.65±0.07vs1.48±0.04,p＞0.05)。
　　(五)BALF中炎癥因子IL-6、IL-13、

14、TNF-α的含量
　　與對照組相比(170±19)pg/ml,LPS組大鼠的BALF中IL-6的含量(310±37)pg/ml升高明顯,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05),干預(yù)組與LPS組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。與對照組相比(83±8)pg/ml,LPS組大鼠的BALF中IL-13的含量(53±9)pg/ml降低明顯,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05),干預(yù)組與LPS組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。與對照組相比(

15、149±12) pg/ml,LPS組大鼠的BALF中TNF-α含量(280±40) pg/ml呈明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05),干預(yù)組與LPS組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.急性肺損傷大鼠肺組織中的POSTN表達水平明顯升高。
　　2.纈沙坦可以通過拮抗AngⅡ受體來降低POSTN的表達,從而降低肺組織的炎癥反應(yīng)及水腫程度,也就是降低了ALI大鼠肺組織的損傷程度,起到肺保護作用