1、過敏反應(yīng)在臨床上經(jīng)常發(fā)生，嚴重時可致人死亡，尤以中藥注射液、注射用藥用輔料、β-內(nèi)酰胺類抗生素等藥物最為突出，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，這些藥物中殘留的大分子蛋白可引起過敏反應(yīng)，故為了保證用藥安全，去除這些雜質(zhì)是非常重要的，藥品生產(chǎn)者也通過不斷的技術(shù)改進盡量去除這些大分子蛋白雜質(zhì)，因此需要建立一個靈敏度高、選擇性好的方法對生產(chǎn)工藝進行驗證和監(jiān)測。然而由于這些藥物生產(chǎn)過程復雜，大分子蛋白在生產(chǎn)過程中可能發(fā)生一系列的聚合、裂解等反應(yīng)，故不適合用基于抗體-

2、抗原反應(yīng)的檢測特異性活性蛋白的免疫法對其進行測定，也不適合使用基質(zhì)影響大、靈敏度低的傳統(tǒng)的光譜法對其進行檢測，故建立一個準確度高、特異性好、靈敏度高的蛋白檢測方法是藥物分析者面臨的一個難題。
　　中藥注射液中的植物蛋白等大分子雜質(zhì)易隨提取過程殘留到終產(chǎn)品中，本文以茵梔黃注射液為研究對象，針對中藥注射液成分復雜但大多是小分子這一特性，利用根據(jù)分子量大小對化合物進行分離的高效凝膠排阻色譜法（HPSEC）分析技術(shù)對其中的大分子蛋白含量進

3、行了研究，為了進一步提高靈敏度，優(yōu)選了檢測波長，選取蛋白吸收更高的末端吸收作為檢測波長。色譜柱為 TSK gel SuperSW2000色譜柱（4μm,4.6×300 mm），流動相為磷酸鹽緩沖溶液，流速為0.3 mL/min，紫外檢測波長為220 nm，樣品溶液經(jīng)過濾后可直接進樣，結(jié)果該方法在0.312-40.0μg/mL線性范圍內(nèi)關(guān)系良好（R2=0.999），回收率均大于81％，重復性良好，RSD為0.6%，檢測限可以達到0.104

4、μg/mL，靈敏度比常用的測定蛋白的靈敏度最高的方法考馬斯亮藍法（Bradford）還提高了10倍左右，且只對樣品進行簡單處理即可進行分析，結(jié)果表明，該方法操作簡便快速，重現(xiàn)性好，為其他同類藥物中的大分子雜質(zhì)的檢測提供了一種可借鑒的分析手段。
　　注射用乳糖是注射用藥物生產(chǎn)中一種很好的藥用輔料，但是由于乳糖來源于動物乳清，可能會殘留有微量乳清蛋白引起過敏反應(yīng)，故需要對其中的乳清蛋白進行嚴格控制。本研究同時建立了 HPSEC法和超高

5、效液相色譜-四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF）兩種方法對乳糖中的α-乳白蛋白及β-乳球蛋白進行檢測，HPSEC法使用的色譜柱為 TSK gel SuperSW2000色譜柱（4μm,4.6×300 mm），流動相為磷酸鹽緩沖溶液，流速為0.3 mL/min，紫外檢測波長為220 nm，結(jié)果該方法在α-乳白蛋白和β-乳球蛋白總濃度3.40~68.0μg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回收率均大于87%，重復性良好，RSD為0.5%

6、，檢測限為1.13μg/mL，結(jié)果表明本研究建立的HPSEC法靈敏度較 UPLC-Q-TOF法稍高，且該方法操作簡單快速，成本相對較低，適用性更廣，易于普及，但由于α-乳白蛋白和β-乳球蛋白分子量接近，在 HPSEC色譜柱中不能完全分離，故不能分別對二者進行定量，只能測定二者含量總和。UPLC-Q-TOF法以0.1%三氟乙酸（TFA）水溶液和0.1%TFA乙腈溶液為流動相進行梯度洗脫，經(jīng)蛋白柱分離后，采用飛行時間質(zhì)譜檢測器（TOF）進行

7、全離子掃描模式檢測。應(yīng)用 Peakview1.2分析軟件，通過對化合物離子精確質(zhì)荷比、特征二級質(zhì)譜以及保留時間的比對，對目標物進行驗證。α-乳白蛋白和β-乳球蛋白測定的線性范圍分別在2.00~80.0μg/mL和6.00~240.0μg/mL之間，相關(guān)系數(shù)為0.997和0.996;檢測限分別為1.00μg/mL和3.00μg/mL;加樣回收率分別為82.9%~87.2%和96.1%~98.4%。結(jié)果表明，本方法特異性好，結(jié)果準確，但對蛋

8、白直接測定靈敏度并不高。故在實際檢測中，若需要操作簡單快速，成本較低，靈敏度高且需對兩種蛋白總和進行檢測時可選用HPSEC法；若需要對蛋白特異性要求較高，對蛋白分別進行鑒定和檢測且靈敏度要求不高時可采用 UPLC-Q-TOF；若需要對蛋白特異性要求較高且靈敏度要求也較高時，可對 UPLC-Q-TOF法前處理進一步研究，使大分子裂解成分子量較小的化合物再進行檢測。
　　青霉素類等β-內(nèi)酰胺類抗生素因其發(fā)酵工藝，易產(chǎn)生并殘留大分子蛋白

9、，本研究以青霉素 V鉀為模型藥物，建立了一個中空纖維離心超濾（HFCF-UF）裝置對蛋白大分子進行分離和富集，然后經(jīng)末端吸收的HPSEC法對大分子進行分析測定。色譜柱為TSK gel SuperSW2000色譜柱（4μm,4.6×300 mm），流動相為磷酸鹽緩沖溶液，流速為0.3 mL/min，紫外檢測波長為220 nm，樣品溶液經(jīng) HFCF-UF一步離心富集可直接進樣，并對非特異性吸附（NSB）現(xiàn)象進行了考察。結(jié)果該方法富集倍數(shù)高達