1、肌萎縮側索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是成年發(fā)病的以大腦運動皮層、腦干和脊髓中運動神經(jīng)元受累為特征的神經(jīng)變性疾病。流行病學顯示，絕經(jīng)期前男性發(fā)病率明顯高于女性，約為3-4∶1，絕經(jīng)后這種差異減小，男女發(fā)病率約為1∶1。研究發(fā)現(xiàn)，雄性SOD1G93A轉基因小鼠發(fā)病時間早于雌性小鼠，卵巢摘除使小鼠壽命縮短，摘除卵巢后給予雌二醇明顯延緩疾病進展。流行病學研究及實驗研究均提示雌激素對ALS的發(fā)病及進

2、展可能有保護作用。
　　雌激素(Estrogen，E)是一種甾體類固醇性激素。除參與生育、性活動外，近年來發(fā)現(xiàn)雌二醇與其受體(estrogen receptor,ER)包括核受體ERα及β及膜受體GPR30結合后，調控基因表達、激活APMK、Akt通路，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等作用，從而發(fā)揮的神經(jīng)保護作用。以往的研究多集中于AD、PD及卒中等發(fā)病過程中雌激素的腦保護機制研究，而對脊髓疾病的保護機制則集中于急性脊髓損傷、多發(fā)性硬化

3、及體外的單細胞保護的研究，對肌萎縮側索硬化的神經(jīng)保護機制未見報道。
　　如上所述，雌激素的生物功能主要由與受體結合后完成，以往研究發(fā)現(xiàn)ERα及ERβ在脊髓主要在后角Ⅰ-Ⅲ層表達，參與痛覺調節(jié)，而在脊髓前角的分布未見系統(tǒng)的描述，為了研究雌激素的保護機制需要全面了解其受體的表達特征。
　　基于此，本實驗應用免疫組化及激光共聚焦的方法觀察，雌激素核受體在SOD1G93A轉基因鼠腰段脊髓表達特征，為進一步研究雌激素在ALS發(fā)病過程中

4、的神經(jīng)保護作用提供理論依據(jù)及可能的靶點。本研究分為兩部分，內容如下:
　　第一部分ERα在成年雄性小鼠腰段脊髓前角的表達特征
　　目的:觀察ERα在成年雄性小鼠腰段脊髓前角運動神經(jīng)元的表達。
　　方法:
　　1、實驗動物
　　成年雄性CD1小鼠
　　2、免疫組化
　　10％水合氯醛將成年雄性小鼠麻醉后，心臟灌注4％多聚甲醛固定20min，取小鼠脊髓腰段以4％多聚甲醛固定48h，振動切片25μm厚

5、，免疫組織化學法觀察ERα在成年雄性小鼠腰段脊髓前角運動神經(jīng)元的表達特征。
　　3、免疫熒光染色
　　將固定好的腰段脊髓震蕩切片成25μm厚，應用免疫熒光染色的方法在激光共聚焦顯微鏡下觀察ERα在成年雄性小鼠腰段脊髓前角運動神經(jīng)元的細胞定位。
　　結果:
　　在成年雄性小鼠腰段脊髓，ERα在前角中有表達，表達部位主要位于運動神經(jīng)元，且胞核高表達，胞漿中量表達。免疫熒光染色證實是α-運動神經(jīng)元。
　　結論:<

6、br>　　ERα在成年雄性小鼠脊髓前角運動神經(jīng)元的胞核高表達，在胞漿中量表達。
　　第二部分ERβ在SOD1G93A轉基因鼠腰段脊髓表達特征
　　目的:觀察不同病變時期SOD1G93A轉基因小鼠ERβ的表達特征。
　　方法:
　　1、模型建立及分組
　　飼養(yǎng)繁殖家族性肌萎縮側索硬化動物模型SOD1G93A轉基因鼠，分為癥狀前期（相當于60天）、癥狀期（相當于90天）及終末期（相當于120天）3組，同窩別未轉

7、基因的為對照組，每組各3只小鼠。
　　2、取材
　　實驗動物經(jīng)10％水合氯醛腹腔內麻醉后，4％多聚甲醛經(jīng)心臟灌注固定20min，留取小鼠脊髓腰膨大，在4％多聚甲醛固定48h。
　　3、免疫組化染色
　　固定后的組織塊震蕩切片25μm厚，應用免疫組織化學SP法進行染色，觀察ERβ在SOD1G93A轉基因小鼠及對照組小鼠各時期腰段脊髓前角的表達特征。計數(shù)雙側脊髓前角ERβ免疫陽性α運動神經(jīng)元的數(shù)量。
　　4、免

8、疫熒光染色
　　4％多聚甲醛固定的組織塊震蕩切片25μm厚，應用免疫熒光染色法進行染色后在激光共聚焦顯微鏡下觀察SOD1G93A轉基因小鼠腰段脊髓ERβ的細胞定位。
　　5、統(tǒng)計學處理
　　采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理。采用均數(shù)±標準差表示腰段脊髓切片兩側脊髓前角α運動神經(jīng)元計數(shù)之和，三組數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析，兩組數(shù)據(jù)的比較采用兩個獨立樣本比較的t檢驗，以P=0.05為顯著性檢驗標準。

9、>　　結果:
　　1、SOD1G93A轉基因鼠的鑒定
　　子代鼠基因組DNA經(jīng)PCR擴增后、在GBOX-HR全自動凝膠成像系統(tǒng)下其瓊脂糖凝膠電泳，mSOD1的PCR產物為236bp，若200-300bp之間的有條帶，則該小鼠為SOD1G93A轉基因鼠，若無此條帶，則為非SOD1G93A轉基因鼠，即陰性小鼠。
　　2、ERβ免疫組化
　　2.1 ERβ在對照組小鼠脊髓灰、白質均有表達，主要表達于細胞核;灰質表達較白

10、質更明顯;脊髓后角Ⅰ-Ⅲ層高表達，脊髓前角廣泛表達，但表達密度較低。SOD1G93A轉基因鼠癥狀前期腰段脊髓ERβ的表達方式及強度與對照組無明顯區(qū)別。
　　2.2隨著病情進展，SOD1G93A轉基因鼠脊髓前角ERβ免疫陽性α運動神經(jīng)元數(shù)目逐漸減少，在癥狀前期、發(fā)病早期、終末期分別為24.30±1.25、14.40±1.50、3.1.±2.28，且各病變時期間均有顯著性差異(P＜0.05);而對照組分別為23.40±3.17、24.

11、00±1.70、22.20±1.32，各時期間無顯著性差異（P＞0.05）。發(fā)病早期、終末期SOD1G93A轉基因鼠組與對照組相比均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。
　　3、免疫熒光染色
　　ERβ在小鼠脊髓前角α運動神經(jīng)元及星型膠質細胞、小膠質細胞的胞核均有表達，脊髓前角α運動神經(jīng)元胞漿少量表達。隨病程的進展，SOD1G93A轉基因鼠脊髓前角ERβ免疫陽性的運動神經(jīng)元數(shù)目逐漸減少，反應性星形膠質細胞及小膠質細胞的胞核也有ER