1、腫瘤壞死因子（TNF-a）是一種主要由活化的單核/巨噬細胞產生的多效性細胞因子，可介導不同靶細胞增殖、分化、壞死及凋亡，具有廣泛的免疫調節(jié)作用和病理生理作用，它在體內以跨膜型（Transmembrane TNF-a，mTNF-a）和分泌型（secreted TNF-a，sTNF-a）兩種形式發(fā)揮作用。近來研究報道，在慢性炎癥的局部和腫瘤組織中聚集有大量的未成熟髓樣抑制細胞（myeloid derived suppressor cell，

2、MDSC），包括未成熟的巨噬細胞、樹突狀細胞和粒細胞等，具有很強的免疫抑制作用，是引起腫瘤免疫逃逸的重要細胞群體[5-8]。有研究發(fā)現：MDSC浸潤腫瘤組織后可分化為腫瘤相關巨噬細胞（TAM）和血管內皮細胞[9]，這兩類細胞又是腫瘤組織中主要的基質細胞，能分泌大量TNF-a，TAM表達的跨膜型TNF-a能通過細胞間直接接觸而介導活化的CD8+T細胞凋亡，這些數據提示MDSC的聚集及其免疫抑制功能很與TNF-a有關。為研究跨膜型和分泌型T

3、NF-a對髓樣抑制細胞功能的影響及其機制，本課題構建了鼠sTNF-pTriex4hisC重組質粒并高效表達了鼠sTNF-a重組蛋白，為后續(xù)的科研工作創(chuàng)造了條件。本研究主要內容如下：
　　 ㈠WT-TNF-pcDNA3.1C重組質粒的構建及鑒定。
　　 ⑴提取小鼠腹腔巨噬細胞的總RNA，采用RT-PCR擴增出野生型TNF-a （WT-TNF）的cDNA片斷；同時，抽提質粒pcDNA3.1C，將二者分別用BamHI和EcoR

4、 I雙酶切后，經回收、連接、轉化大腸桿菌DH5a，挑選陽性克隆。
　　 ⑵陽性克隆的鑒定：以菌落PCR初步篩選陽性克隆，再用上述限制性內切酶雙酶切鑒定，結果顯示重組體經酶切后，得到約708bp左右的目的片斷，與連接的目的基因大小一致。進一步經DNA測序分析鑒定，證明成功構建了插入有WT-TNF全長序列的重組質粒鼠WT-TNF-pcDNA3.1C。
　　 ㈡sTNF-pTriex4hisC重組質粒的構建及鑒定。
　　

5、 ⑴重組體的構建和克?。阂訵T-TNF-pcDNA3.1C質粒為模板，采用重疊PCR方法刪除WT-TNF中的信號肽序列，從而得到僅僅只含有分泌型TNF-a的DNA序列片段，再用BamHI和EcoR I將該目的基因和 pTriex4hisC載體（此載體中含組氨酸his標簽，有利于后續(xù)的蛋白純化）進行雙酶切，然后，經回收、連接、轉化大腸桿菌DH5a，挑選陽性克隆。
　　 ⑵陽性克隆的鑒定：以菌落PCR初步篩選陽性克隆，再用上述限制

6、性內切酶雙酶切進行鑒定，結果顯示重組體經酶切后，得到約471bp左右的目的片斷，與連接的目的基因大小一致。進一步經DNA測序分析鑒定，證明成功構建鼠sTNF-pTriex4hisC重組質粒。
　　 ㈢鼠sTNF-a融合蛋白的誘導表達及鑒定。
　　 將sTNF-a-pTriex4hisC重組質粒轉染大腸桿菌BL-21，經IPTG誘導，獲得鼠融合蛋白sTNF-a；用Ni2+－NTA介質分離純化sTNF-a蛋白后，經SDS－P