1、已知魚類內(nèi)耳突變基因中約1/3與人類綜合征性和非綜合征性耳聾有關(guān)。斑馬魚(zebrafish)作為一種重要的脊椎動(dòng)物模式生物，雖然沒有外耳和中耳，但具有脊椎動(dòng)物典型的內(nèi)耳結(jié)構(gòu)，其內(nèi)耳毛細(xì)胞組織形態(tài)和分子構(gòu)成均與哺乳動(dòng)物內(nèi)耳毛細(xì)胞極為相似[1]。
　　順鉑為第一代臨床化療鉑類藥物之一，在治療鼻咽癌等頭頸部惡性腫瘤中發(fā)揮著重要作用[2]。然而順鉑在治療腫瘤的同時(shí)，也會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不同程度的毒副作用。據(jù)報(bào)道接受順鉑化療的惡性腫瘤患者中，約

2、93％出現(xiàn)漸進(jìn)性或不可逆性感音神經(jīng)性聾，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。
　　STAT3是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子家族家族(STATs)中重要的一員，它是一種脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白，具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能，是JAK-STAT信號(hào)通路的重要環(huán)節(jié)[5]。正常組織細(xì)胞中，STAT3主要參與細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等過程。生長因子、細(xì)胞因子等多肽類配體在細(xì)胞表面與相應(yīng)的受體結(jié)合，受體在胞漿內(nèi)與受體型酪氨酸蛋白激酶JAKs相結(jié)合，受體上的酪氨酸殘基磷酸

3、化并使使JAKs活化;活化的JAKs和受體募集細(xì)胞漿內(nèi)的STAT3，并激活STAT3。
　　目的:
　　建立幼年斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞順鉑損傷模型;研究STAT3在幼年斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞順鉑損傷中的作用。
　　方法:
　　1.順鉑損傷幼年斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞及損傷后毛細(xì)胞數(shù)量和凋亡信號(hào)檢測
　　1.1 順鉑處理受精后第5天(5dpf) AB品系斑馬魚
　　用系統(tǒng)水將順鉑粉末溶解至3333uM，-20℃儲(chǔ)存。取受精

4、后第5天(5dpf)AB品系幼年斑馬魚，隨機(jī)分為系統(tǒng)水對(duì)照組、不同濃度(125uM、250uM、500uM、750uM、1000uM)順鉑處理組，分別作用1h，2h，3h，4h，6h。每組7條魚。重復(fù)3次。
　　1.2 幼年斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞染色
　　系統(tǒng)水對(duì)照組及順鉑處理組分別處理1h，2h，3h，4h，6h后，棄掉處理液，用PBS液清洗，每次5min，共3次。然后置于2uM熒光活性染液Yo-Pro-1中避光染色1h，棄掉Y

5、o-Pro-1熒光活性染液，用PBS液清洗，每次5min，共3次。用0.02％ MESS麻醉后，置于凹面載玻片上，用注射器針頭調(diào)整斑馬魚體位，熒光顯微鏡下觀察、拍照，選擇SO1、SO2、O1、OC1四個(gè)固定神經(jīng)丘進(jìn)行毛細(xì)胞計(jì)數(shù)。
　　1.3 幼年斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞凋亡檢測
　　取受精后第5天(5dpf)AB品系幼年斑馬魚，隨機(jī)分為系統(tǒng)水對(duì)照組、250uM順鉑處理組，分別處理3h。棄掉處理液，用PBS清洗，每次5min，共3次。

6、然后于TUNEL染液中避光染色1h，棄掉TUNEL染色液，用PBS液清洗，每次5min，共3次。將斑馬魚置于凹面載玻片上，用注射器針頭調(diào)整斑馬魚體位，熒光顯微鏡下觀察、拍照，計(jì)數(shù)毛細(xì)胞凋亡信號(hào)。每組10條。重復(fù)3次。
　　2.中性粒細(xì)胞可能參與了順鉑對(duì)斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞的損傷過程
　　取5dpf轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(lyz∶DsRed)，隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組用250uM順鉑處理3h，對(duì)照組加入等量系統(tǒng)水。處理完畢，用系統(tǒng)

7、水清洗。置于2uM YO-Pro-1中避光染色1h，系統(tǒng)水漂洗3次，每次5min。在熒光顯微鏡下觀察。每組10條魚，重復(fù)3次。
　　3.STAT3在幼年斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞順鉑損傷中激活
　　3.1 RT-q PCR方法檢測幼年斑馬魚STAT表達(dá)（詳細(xì)步驟見實(shí)驗(yàn)方法）
　　3.2 原位雜交方法檢測幼年斑馬魚神經(jīng)丘STAT3表達(dá)（詳細(xì)步驟見實(shí)驗(yàn)方法）。
　　4.N-乙酰半胱氨酸(NAC)減弱順鉑對(duì)幼年斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞的

8、損傷
　　4.1 N-乙酰半胱氨酸和順鉑聯(lián)合處理5dpfAB品系斑馬魚
　　取5dpf幼年斑馬魚，隨機(jī)分為對(duì)照組、順鉑處理組和NAC+順鉑處理組，NAC+順鉑處理組先用不同濃度N-乙酰半胱氨酸(NAC)(10uM、50uM、100uM、200uM)處理2h，然后加入250uM順鉑溶液處理3h，順鉑處理組只用250uM順鉑溶液處理3h，對(duì)照組加入等量系統(tǒng)水。
　　4.2 斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞染色
　　對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組分別

9、處理3h后，棄掉處理液，用PBS液清洗，每次5min，共3次。然后于2uM熒光活性染液Yo-Pro-1中避光染色1h，棄掉Yo-Pro-1熒光活性染液，用PBS液清洗，每次5min，共3次。用0.02％ MESS麻醉后，置于凹面載玻片上，調(diào)整斑馬魚體位充分暴露待觀察神經(jīng)丘，熒光顯微鏡下觀察、拍照，選擇SO1、SO2、O1、OC1四個(gè)固定神經(jīng)丘進(jìn)行毛細(xì)胞計(jì)數(shù)。
　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　資料分析采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，

10、數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，兩因素多水平比較采用重復(fù)測量的方差分析，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，單因素多水平比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，方差齊性檢驗(yàn)采取Levene檢驗(yàn)，方差齊者用LSD-t法，方差不齊者用Dunnett-t法。設(shè)P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.順鉑損傷幼年斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞
　　用順鉑處理后計(jì)數(shù)SO1、SO2、O1、OC1四個(gè)神經(jīng)丘得出毛細(xì)胞均數(shù)。

11、正常斑馬魚側(cè)線這四個(gè)神經(jīng)丘毛細(xì)胞均數(shù)為10.4167±0.92983;用250uM順鉑處理3h后，計(jì)數(shù)毛細(xì)胞均數(shù)為5.2381±0.81577;用250uM順鉑處理6h后，計(jì)數(shù)毛細(xì)胞均數(shù)為0.0357±0.08964;用1000uM順鉑處理3h后，計(jì)數(shù)毛細(xì)胞均數(shù)為0.5±0.45415;用1000uM順鉑處理6h后，計(jì)數(shù)毛細(xì)胞均數(shù)為0±0。經(jīng)統(tǒng)計(jì)各順鉑處理組的側(cè)線毛細(xì)胞數(shù)量均少于正常對(duì)照組，且以上處理組與對(duì)照組相比，毛細(xì)胞數(shù)量的差異均有

12、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。從數(shù)據(jù)可看出，斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞數(shù)量隨順鉑濃度的增加逐漸減少，且順鉑作用時(shí)間越長，側(cè)線毛細(xì)胞數(shù)量減少越明顯。這說明順鉑對(duì)斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞的損傷具有濃度和時(shí)間依賴性。
　　2.順鉑損傷后幼年斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞的凋亡檢測通過TUNEL染色觀察斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘毛細(xì)胞凋亡信號(hào)，250uM順鉑處理3h后，側(cè)線神經(jīng)丘毛細(xì)胞凋亡信號(hào)數(shù)為:0.7333±0.14710。對(duì)照組神經(jīng)丘毛細(xì)胞凋亡信號(hào)數(shù)為:0.0883±0.13

13、786。順鉑處理組側(cè)線毛細(xì)胞凋亡信號(hào)數(shù)大于對(duì)照組(P＜0.01)。說明順鉑導(dǎo)致側(cè)線毛細(xì)胞損傷可通過細(xì)胞凋亡的方式實(shí)現(xiàn)。
　　3.中性粒細(xì)胞可能參與了順鉑對(duì)斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞的損傷過程
　　中性粒細(xì)胞是由骨髓造血干細(xì)胞分化發(fā)育并進(jìn)入血液、組織中，正常情況下，血液中的中性粒細(xì)胞一般附著于血管壁上，另一半隨血液循環(huán)。在機(jī)體需要時(shí)骨髓中儲(chǔ)備的大量成熟中性粒細(xì)胞會(huì)立即進(jìn)入血循環(huán)。在用順鉑處理斑馬魚的過程中，神經(jīng)丘附近有中性粒細(xì)胞聚集現(xiàn)象

14、，并且在顯微鏡下觀察數(shù)分鐘，我們觀察到了中性粒細(xì)胞向神經(jīng)丘移動(dòng)的現(xiàn)象;而對(duì)照組斑馬魚沒有此現(xiàn)象。
　　由此可推斷，中性粒細(xì)胞可能參與了順鉑對(duì)斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞的損傷過程，但是中性粒細(xì)胞在此過程中起到的具體作用有待進(jìn)一步觀察。
　　4.STAT3在順鉑導(dǎo)致的斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞損傷中表達(dá)上調(diào)
　　原位雜交結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組側(cè)線神經(jīng)丘STAT3信號(hào)高于對(duì)照組，且順鉑處理3h時(shí)信號(hào)高于順鉑處理6h時(shí)，提示順鉑處理3h時(shí)STAT3表達(dá)

15、最高。熒光實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果與原位雜交結(jié)果相符合。STAT3抑制劑S3I-201+順鉑處理組與順鉑處理組的側(cè)線毛細(xì)胞數(shù)分別為:3.6364±0.71906，2.25±0.55572，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。然而與系統(tǒng)水對(duì)照組的9.3462±0.99759相比，仍明顯減少(P＜0.01)。
　　5.N-乙酰半胱氨酸(NAC)可減弱順鉑對(duì)幼年斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞的損傷
　　NAC+順鉑聯(lián)合處理組斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞數(shù)分別為

16、:4.4±0.5525，5.4531±0.8814，6.0625±1.1893，7.4706±0.4039。順鉑處理組斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞數(shù)為:3.5833±0.9885。對(duì)照組斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞數(shù)為:9.25±0.9843。統(tǒng)計(jì)顯示NAC預(yù)處理后再用順鉑處理的斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞數(shù)量明顯高于只用順鉑處理的斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞數(shù)(P＜0.01)，且隨著N-乙酰半胱氨酸濃度的增加，保護(hù)作用越強(qiáng)，推測ROS在順鉑造成的側(cè)線毛細(xì)胞損傷中起著重要作用。

17、>　　結(jié)論:
　　1.用浸泡斑馬魚的方法建立斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞順鉑損傷模型可行，且順鉑對(duì)斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞的損傷存在時(shí)間和濃度依賴性;順鉑導(dǎo)致斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘毛細(xì)胞的死亡可通過細(xì)胞凋亡的方式實(shí)現(xiàn)。
　　2.中性粒細(xì)胞可能參與了順鉑對(duì)斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞的損傷過程，需進(jìn)一步觀察中性粒細(xì)胞參與該損傷過程的方式，探討中性粒細(xì)胞捕獲機(jī)制(NETs)是否參與該過程。
　　3.STAT3在順鉑導(dǎo)致的斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞損傷中表達(dá)上調(diào);抑制ST