1、隨著生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，單克隆抗體技術(shù)在免疫治療、免疫分析、免疫純化等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。在單克隆抗體的制備和篩選中，最重要的工作之一是對(duì)不同細(xì)胞株分泌的抗體的親和力這一關(guān)鍵指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。因此，研究快速、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確的抗體親和力測(cè)定新方法對(duì)于單克隆抗體的應(yīng)用具有非常重要的指導(dǎo)意義。微透析（microdialysis，MD）是一種微量采樣技術(shù)，具有可原位、活體采樣和在線、實(shí)時(shí)檢測(cè)等特點(diǎn)。其工作原理是外部介質(zhì)中的小分子物質(zhì)在濃度梯度差的作用

2、下，被動(dòng)擴(kuò)散通過(guò)透析膜到達(dá)探針腔中，而蛋白質(zhì)和細(xì)胞等大分子物質(zhì)則被阻擋在外，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)小分子物質(zhì)的采樣。流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光（flow injection-chemiluminescence，F(xiàn)I-CL）法是將微量、高速和自動(dòng)化的進(jìn)樣技術(shù)與高靈敏度的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)結(jié)合而提出的一種痕量分析方法。其原理是待測(cè)物濃度與化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度在一定范圍內(nèi)呈線性定量關(guān)系，利用儀器對(duì)反應(yīng)體系化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的測(cè)定，來(lái)確定待測(cè)物含量。本文將MD應(yīng)用于小分子半抗原采樣

3、，結(jié)合高靈敏度的FI-CL分析，以β-激動(dòng)劑這一不宜直接標(biāo)記的小分子半抗原為例，在均相條件下研究這些小分子半抗原與抗體間的親和力，建立了MD-FI-CL的在線聯(lián)用方法，用于測(cè)定抗體親和力，為小分子半抗原的抗體性能評(píng)價(jià)提供了一個(gè)新型的分析方法平臺(tái)。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴利用在線MD采樣方法，結(jié)合高靈敏度的FI-CL分析法，在均相體系中研究特布他林與其單克隆抗體之間的親和力，提出了用于測(cè)定單克隆抗體親和力的免標(biāo)記型新方法。MD探

4、針可以將結(jié)合型特布他林及游離型抗體阻擋在半透膜外，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)小分子半抗原（特布他林）的取樣，隨后將含有游離型半抗原的透析液注入FI-CL系統(tǒng)。堿性條件下，特布他林對(duì)魯米諾-鐵氰化鉀系統(tǒng)的化學(xué)發(fā)光有較強(qiáng)的增敏作用，因此，通過(guò)測(cè)定化學(xué)發(fā)光信號(hào)，可以實(shí)現(xiàn)透析液中特布他林的檢測(cè)。并通過(guò)MD探針的回收率校正，計(jì)算出免疫反應(yīng)體系中游離半抗原的濃度，最后通過(guò)Scatchard和Klotz公式，計(jì)算得到特布他林單克隆抗體的親和力。兩種計(jì)算方法所得結(jié)果均

5、為4.9×106 M-1，說(shuō)明特布他林單克隆抗體是中等親和力的抗體，該結(jié)果與硫氰酸鹽洗脫法所得結(jié)果一致。該方法操作簡(jiǎn)便、成本低、分析時(shí)間短，為單克隆抗體親和力的測(cè)定提供了新的途徑。⑵基于在線MD和FI-CL的聯(lián)用技術(shù)構(gòu)建了一種測(cè)定抗體親和力的免標(biāo)記型新方法，用于直接測(cè)定萊克多巴胺與其單克隆抗體間的親和力常數(shù)。MD探針可以將結(jié)合型萊克多巴胺及游離型抗體阻擋在半透膜外，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)免疫反應(yīng)體系中游離型萊克多巴胺的取樣，隨后將含有游離型半抗原的

6、透析液注入FI-CL系統(tǒng)。堿性條件下，萊克多巴胺對(duì)魯米諾-高錳酸鉀系統(tǒng)的化學(xué)發(fā)光有較強(qiáng)的增敏作用，因此，通過(guò)測(cè)定化學(xué)發(fā)光信號(hào)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)透析液中萊克多巴胺的檢測(cè)。并通過(guò)MD探針的回收率校正，計(jì)算出免疫反應(yīng)體系中游離半抗原的濃度，最后通過(guò)Scatchard和Klotz分析，計(jì)算得到萊克多巴胺單克隆抗體的親和力。兩種分析方法所得結(jié)果均為1.0×106 M-1，說(shuō)明萊克多巴胺單克隆抗體是中等親和力的抗體，該結(jié)果與硫氰酸鹽洗脫法所得結(jié)果一致。因