1、目的： 應(yīng)用DNA家族改組方法提高TEM型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的活性，預(yù)測(cè)三級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)探討TEM型ESBLs結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系，為新型β-內(nèi)酰胺類抗菌素清除劑的研制打下基礎(chǔ)。 方法： 1.blaTEM突變文庫(kù)的構(gòu)建、篩選和序列測(cè)定經(jīng)DNA家族改組獲得與原基因大小相同的改組后基因，將其克隆入原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)，構(gòu)建突變文庫(kù)。利用酶的催化特點(diǎn)建立了基于平皿初篩和瓊脂稀釋法復(fù)篩的篩選體系，該篩選系統(tǒng)以最低抑

2、菌濃度為指標(biāo)。對(duì)活性增高菌株blaTEM基因進(jìn)行序列測(cè)定，并預(yù)測(cè)分析其蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)。 2.重組質(zhì)粒pET28a-blaTEM-3和pET28a-blaTEMm-2在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)及其優(yōu)化將重組質(zhì)粒pET28a-blaTEM-3和pET28a-blaTEMm-2(從突變株MutE-11獲得)轉(zhuǎn)化入EcoliBL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE分析。在不同條件下(誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間和IPTG濃度)誘導(dǎo)表達(dá)后

3、比較不同條件下重組蛋白表達(dá)情況，以選擇最佳的誘導(dǎo)條件。 3.重組TEM-3型ESBL和FEMm-2ESBL包涵體的復(fù)性和純化及其酶動(dòng)力學(xué)分析大量表達(dá)分離重組TEM-3型ESBL和TEMm-2ESBL包涵體，并用2mol/L，尿素和1％TritonX-100反復(fù)洗滌。以8mol/L尿素溶解包涵體，將包涵體裂解液上樣于弱陰離子交換柱DEAESepharoseFF，進(jìn)行柱上復(fù)性，復(fù)性產(chǎn)物進(jìn)一步用分子篩SephadexG-75純化。復(fù)

4、性純化產(chǎn)物進(jìn)行酶動(dòng)力學(xué)分析，比較改組前后酶動(dòng)力學(xué)變化情況。 結(jié)果： 1.突變文庫(kù)的篩選及突變株的序列分析經(jīng)過(guò)一輪DNA家族改組成功構(gòu)建突變文庫(kù)，并篩選獲得兩株耐藥性增加的突變株MutE-7和MutE-11，MutE-7菌株耐藥性增高不明顯，除CAZ對(duì)其MIC較對(duì)改組前的菌株有4-8倍增加外，其他抗生素對(duì)其MIC沒(méi)有變化，其核苷酸序列有7個(gè)堿基替換，氨基酸改變?yōu)镋104K，R164S：而對(duì)于MutE-11菌株，耐藥性增

5、高表現(xiàn)為MIC值增高2-4倍(AMP)、4-8倍(CEZ)、4-8倍(CXM)、16-32倍(CAZ)、8倍以上(CRO)和4-8倍(CTX)，其核苷酸序列有7個(gè)堿基替換，氨基酸改變?yōu)镾59G，R164S，A237T和E240K。 2.重組質(zhì)粒在原核系統(tǒng)中的誘導(dǎo)表達(dá)及優(yōu)化重組菌pET28a(+)-blaTEM-3/BL21(DE3)和pET28a(+)-blaTEMm-2/BL21(DE3)在EcoliBL21(DE3)中上清

6、表達(dá)較少，主要以包涵體形式表達(dá)，通過(guò)優(yōu)化誘導(dǎo)條件顯示IPTG濃度為0.1mmol/L、誘導(dǎo)溫度為30℃、誘導(dǎo)時(shí)間4h以上能高效表達(dá)TEMm-2ESBL。 3.TEM-3型ESBL和TEMm-2ESBL包涵體的復(fù)性和純化及酶動(dòng)力學(xué)分析變性的重組TEM-3型ESBL和TEMm-2ESBL包涵體經(jīng)陰離子交換層析柱DEAESF.F.柱上復(fù)性、純化和分子篩SephadexG-75進(jìn)一步純化后純度達(dá)90％。改組前后TEM型ESBL酶動(dòng)力學(xué)

7、分析結(jié)果顯示，經(jīng)DNA家族改組TEMm-2ESBL對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的催化效率有不同程度的改變，與改組前TEM-3型ESBL相比對(duì)青霉素G和氨芐青霉素的Kcat/Km分別增高1.5倍和4.4倍，對(duì)頭孢唑啉和頭孢他啶的Kcat/Km分別增高3.1倍和2.8倍，而對(duì)頭孢曲松和頭孢噻肟的Kcat/Km卻分別降低了1.7倍和2.5倍。 結(jié)論： 改組后菌株的TEM型ESBLs活性提高，DNA家族改組是一種有效地改善酶活性的體