1、背景: 超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)是由質(zhì)粒介導(dǎo)的能水解氧亞氨基內(nèi)酰胺及單環(huán)內(nèi)酰胺類抗生素的一類酶，是導(dǎo)致肺炎克雷伯菌等腸桿菌科細(xì)菌對第三代頭孢菌素發(fā)生耐藥的重要機制。產(chǎn)ESBLs菌株可以通過質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子進行傳播，易導(dǎo)致菌株之間傳播和院內(nèi)感染的爆發(fā)流行。近年來，產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌所致的院內(nèi)感染已呈世界性流行，成為急需解決的醫(yī)療事件和公共衛(wèi)生問題。由于不同的國家、地區(qū)、醫(yī)院使用抗菌藥物的不同，產(chǎn)ESBL肺炎克雷伯菌的檢出

2、率、耐藥性及基因型也有所不同。不同的基因型ESBL因其活性位點不同，分解底物有所不同。了解本地區(qū)ESBLs基因流行情況對臨床合理用藥、防止耐藥菌的產(chǎn)生具有重要的意義。 測序是目前公認(rèn)的ESBLs基因分型的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但儀器昂貴、操作繁瑣、費時費力，不適合作為一種篩查的方法用于ESBL的分子流行病學(xué)監(jiān)測。變性高效液相色譜分析(DHPLC)是在部分變性的條件下，異源雙鏈因錯配區(qū)的存在，在色譜柱保留時間短于同源雙鏈，而先被洗脫出來，

3、DHPLC具有簡便快捷、準(zhǔn)確靈敏和高通量、自動化的特點，被應(yīng)用于對已知或未知的基因突變、小片段插入或缺失等DNA序列變異的篩查。近年，國外學(xué)者運用PCR-DHPLC技術(shù)對耐氟喹諾酮淋病雙球菌、耐喹諾酮金黃色葡萄球菌、耐喹諾酮腸道沙門氏菌、耐環(huán)丙沙星鼠疫耶爾森菌進行分析，結(jié)果表明通過選擇合適的DHPLC分析條件如柱溫、緩沖液梯度、流速和洗脫時問等，可據(jù)DHPLC洗脫峰峰型和出峰時間檢測和辨別出耐藥菌株，是一種很有應(yīng)用前景的快速檢測方法。

4、 第一部分：產(chǎn)ESBLs菌株的篩選和藥敏試驗 目的:確定產(chǎn)EGBLs肺炎克雷伯菌及了解產(chǎn)ESBLs菌株對常見抗生素的耐藥情況. 方法:采用美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會推薦標(biāo)準(zhǔn)確定產(chǎn)ESBLs菌株；用紙片擴散法測定產(chǎn)ESBLs菌株對常見抗菌藥物的耐藥性，以大腸埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603為質(zhì)控菌。 結(jié)論: 產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌對大部分β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥嚴(yán)重。

5、 第二部分：變性高效液相色譜檢測ESBLs的實驗研究 目的:探討TEM型及SHV型最適的DHPLC檢測條件。 方法:采用WAVEMaker軟件初步預(yù)測柱溫、Buffer緩沖液梯度、流速等DHPLC分析條件，在預(yù)測值上下摸索出最適的DHPLC檢測條件。 結(jié)論: DHPLC可用于ESBLs基因亞型的檢測，洗脫溫度是影響異源雙鏈和同源雙鏈分離效果的重要因素。 第三部分：肺炎克雷伯菌產(chǎn)ESBLs基因型的檢

6、測 目的:對產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌中TEM和SHv型β-內(nèi)酰胺酶進行基因分型，建立TEM型和SHV型DHPLC特異性圖譜，以建立一種檢測TEM型和SHV型β-內(nèi)酰胺酶的方法。 方法:采用TEM型、SHV型β-內(nèi)酰胺酶編碼基因的通用引物對57株產(chǎn)ESBLs臨床菌株進行擴增，運用DHPLC和測序法對其進行分析，通過對比兩者結(jié)果，明確其基因型及建立TEM型和SHV型β-內(nèi)酰胺酶DHPLC特異性圖譜。 結(jié)論: