1、鸚鵡熱嗜衣原體（Chlamydophila psittaci，Cps）是引起寵物鳥和家禽呼吸系統(tǒng)疾病的一種重要病原體。寵物鳥主人、獸醫(yī)和家禽從業(yè)人員很容易感染來自動(dòng)物的鸚鵡熱嗜衣原體而患病。由于其癥狀與普通感冒很相似，在臨床上常常不易發(fā)現(xiàn)而被誤診，導(dǎo)致該疾病得不到及時(shí)有效的治療，致使鸚鵡熱嗜衣原體在患者體內(nèi)持續(xù)存在并引起更嚴(yán)重的并發(fā)癥，如肺炎、肺水腫、心肌炎和心內(nèi)膜炎等。因此，研究鸚鵡熱嗜衣原體致病的分子機(jī)制，闡明相關(guān)毒力效應(yīng)蛋白的致病

2、作用，對(duì)預(yù)防和控制鸚鵡熱嗜衣原體感染有著極其重要的意義。
　?、笮头置谙到y(tǒng)（Type III secretion system，T3SS）效應(yīng)蛋白在衣原體致病過程中發(fā)揮了非常重要的作用。例如：包涵體膜蛋白（Inclusion membrane protein，Inc），易位性復(fù)原活動(dòng)磷酸化蛋白（Translocated actin-recruiting phosphoprotein，Tarp）和Ct694介導(dǎo)沙眼衣原體（Chlam

3、ydia trachomatis，Ct）與宿主細(xì)胞相互作用，影響宿主細(xì)胞正常代謝與功能。鑒于衣原體各種屬之間的相似性，篩選鸚鵡熱嗜衣原體T3SS效應(yīng)蛋白以及研究其生物學(xué)特性能夠?yàn)辂W鵡熱嗜衣原體與宿主細(xì)胞相互作用提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。因此，為了研究鸚鵡熱嗜衣原體致病的分子機(jī)制和闡明鸚鵡熱嗜衣原體T3SS效應(yīng)蛋白的致病作用，我們進(jìn)行了以下三個(gè)部分的研究。
　　第一部分鸚鵡熱嗜衣原體T3SS激活JNK/ERK信號(hào)通路誘導(dǎo)宿主細(xì)胞炎癥反應(yīng)研

4、究
　　鸚鵡熱嗜衣原體是一種嚴(yán)格胞內(nèi)寄生的人獸共患病病原體，通常是由鳥類傳染給人，導(dǎo)致呼吸道感染等多種疾病。目的：初步探討鸚鵡熱嗜衣原體T3SS調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用及其分子機(jī)制。方法：采用體外感染模型，鸚鵡熱嗜衣原體感染不同試劑（包括 T3SS抑制劑INP0007、ERK抑制劑PD98059、JNK抑制劑 SP600125、p38抑制劑SB202190和FeSO4）預(yù)處理的人單核細(xì)胞株THP-1細(xì)胞，利用 ELISA和Q-P

5、CR方法分別檢測(cè)炎癥因子（IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α）的蛋白和mRNA表達(dá)水平，Western blotting檢測(cè)ERK、JNK和p38磷酸化水平。結(jié)果：T3SS抑制劑INP0007抑制鸚鵡熱嗜衣原體的生長(zhǎng)，降低THP-1細(xì)胞 IL-6、IL-8、TNF-α和IL-1β炎癥因子的產(chǎn)生，而外源性鐵可逆轉(zhuǎn)INP0007對(duì)鸚鵡熱嗜衣原體生長(zhǎng)的抑制作用，但是并不能恢復(fù)INP0007對(duì)炎癥因子的抑制作用；ERK和JNK抑制劑能減

6、少鸚鵡熱嗜衣原體誘導(dǎo)炎癥因子的產(chǎn)生，但是p38抑制劑不能減少鸚鵡熱嗜衣原體誘導(dǎo)炎癥因子的產(chǎn)生。結(jié)論：鸚鵡熱嗜衣原體誘導(dǎo)炎癥因子的產(chǎn)生與T3SS有關(guān)，且鸚鵡熱嗜衣原體T3SS通過激活JNK/ERK信號(hào)通路誘導(dǎo)宿主細(xì)胞炎癥反應(yīng)。
　　第二部分鸚鵡熱嗜衣原體T3SS效應(yīng)蛋白的篩選與鑒定研究
　　目的：初步篩選和鑒定鸚鵡熱嗜衣原體T3SS效應(yīng)蛋白。方法：利用生物信息學(xué)的方法，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)鸚鵡熱嗜衣原體T3SS效應(yīng)蛋白進(jìn)行篩選，初

7、步預(yù)測(cè)了CPSIT_0018、CPSIT_0531、CPSIT_p7三種鸚鵡熱嗜衣原體T3SS效應(yīng)蛋白編碼基因；采用 PCR技術(shù)從Cps6BC基因組中擴(kuò)增CPSIT_0018、CPSIT_0531和CPSIT_p7基因，并構(gòu)建pET30a-CPSIT_0018、pET30a-CPSIT_0531和pET30a-CPSIT_p7原核表達(dá)載體，然后分別轉(zhuǎn)化到宿主菌 E.coli BL21中，IPTG分別誘導(dǎo)His-CPSIT_0018、Hi

8、s-CPSIT_0531和His-CPSIT_p7三種融合蛋白的表達(dá)，分別免疫BALB/c小鼠制備對(duì)應(yīng)的多克隆抗體，ELISA分析三種蛋白的免疫原性，間接免疫熒光法觀察 CPSIT_0018、CPSIT_0531和CPSIT_p7蛋白在HeLa細(xì)胞中的分布。結(jié)果：成功構(gòu)建了pET30a-CPSIT_0018、pET30a-CPSIT_0531和pET30a-CPSIT_p7三個(gè)原核載體，并表達(dá)和純化出較穩(wěn)定的重組蛋白；His-CPSIT

9、_0018、His-CPSIT_0531和His-CPSIT_p7三種蛋白均可刺激小鼠產(chǎn)生特定的免疫反應(yīng)，隨著免疫次數(shù)的增加抗體滴度逐漸升高，其中 CPSIT_p7免疫原性最強(qiáng)，抗體滴度為1:1000000，而CPSIT_0018和CPSIT_0531免疫原性相對(duì)較弱，抗體滴度均為1:640000；CPSIT_0018和CPSIT_0531蛋白均定位在鸚鵡熱嗜衣原體的包涵體內(nèi)，與主要外膜蛋白 MOMP的分布模式相似，而與包涵體膜蛋白In

10、cA的分布模式不同，CPSIT_p7蛋白不僅局限于包涵體內(nèi)，在HeLa細(xì)胞胞漿中也可以見到其分布，用 T3SS阻斷劑干擾細(xì)胞后，CPSIT_p7的分布發(fā)生改變，僅位于包涵體內(nèi)，而 CPSIT_0018和CPSIT_0531的分布沒有明顯的改變。結(jié)論：1）獲得了純化的Cps重組蛋白 His-CPSIT_0018，His-CPSIT_0531和His-CPSIT_p7；2） CPSIT_0018，CPSIT_0531和CPSIT_p7重組蛋