1、幾丁質是昆蟲表皮和圍食膜的重要組成成分，昆蟲生長、發(fā)育的各個時期都需要一定量的幾丁質。幾丁質代謝隨昆蟲不同生長發(fā)育階段而變化并保持相對的穩(wěn)定，對昆蟲的正常生長發(fā)育是至關重要的。同時，穿透體壁是在昆蟲病原真菌感染寄主的重要過程之一。幾丁質酶基因轉入植物或者生防微生物(如Bt或病毒1中表達，增加抗蟲或殺蟲效果。為此有必要加強幾丁質酶的研究，為利用基因工程技術改良菌株奠定基礎并提供目的基因。本文通過PCR方法分別從東亞飛蝗 Locusta m

2、igratoria manilensi和金龜子綠僵菌蝗變種Metarhizium anisopliae vat． acridum菌株CQMa102中克隆了幾丁質酶基因，構建了酵母表達載體，通過畢赤酵母對獲得的兩個幾丁質酶基因進行了表達研究，取得了如下進展： ①東亞飛蝗中腸幾丁質酶(LmChi)基因的克隆通過RACE方法，克隆了東亞飛蝗中腸幾丁質酶(LmChi)cDNA全序列(登錄號：EF092841)。獲得的cDNA全長1604

3、 bp，其中開放閱讀框1452 bp，編碼483個氨基酸。編碼的氨基酸序列與18家族昆蟲幾丁質酶有較高的相似性。與其他幾丁質酶一樣，東亞飛蝗幾丁質酶序列也包含一個信號肽、一個幾丁質酶活性位點、一個碳端絲氨酸富集區(qū)和一個幾丁質結合域。 ②LmChi基因的組織定位針對昆蟲幾丁質酶基因時序性表達的特點，本研究通過半定量RT—PCR法研究LmChi基因的組織表達情況。結果表明，LmChi基因只在東亞飛蝗不同發(fā)育階段的中腸組織中表達，而在

4、東亞飛蝗體壁、前腸和后腸均沒有發(fā)現(xiàn)．LmChi基因的轉錄。 ③金龜子綠僵菌蝗變種菌株CQMa102幾丁質酶(MaChi)基因的克隆通過RACE和篩選基因組文庫等方法，克隆了金龜子綠僵菌蝗變種菌株CQMa102幾丁質酶(MaChi)基因的DNA和cDNA序列。部分序列已經登錄到NCBI數(shù)據(jù)庫中(GenBank登錄號：DQ097518)。MaChi基因DNA全序列1973 bp，其中有三段內含子。cDNA全序列1483 bp，蛋白編

5、碼區(qū)長1275 bp，5’端非翻譯區(qū)121 bp，3’端非翻譯區(qū)80 bp。編碼的氨基酸序列與18家族幾丁質酶有較高的相似性。同LmChi 一樣，綠僵菌幾丁質酶序列也包含一個信號肽、一個幾丁質酶活性位點。但沒有幾丁質結合域。 ④LmChi基因和MaChi基因在畢赤酵母中的表達分別將LmChi基因和MaChi基因的成熟肽編碼框連接到表達載體pPIC9K的多克隆位點上，構建了pPIC9K-LmChi和pPIC9K-MaChi重組表達