1、目的:
　　前期，我們團隊已經確證了建立一定的共培養(yǎng)條件可以誘導間充質干細胞轉分化為汗腺樣細胞，并經裸鼠的腳掌創(chuàng)面模型試驗和初步的人體試驗證實，經過誘導的自體骨髓間充質干細胞移植于切除瘢痕的創(chuàng)面，可以生長出汗腺樣結構并且具有一定的發(fā)汗功能。本研究的主要目的是在前期工作的基礎上，通過對成纖維細胞重編程進一步識別控制其分化為汗腺樣細胞的關鍵重編程轉錄因子(NF-κB和Lef-1)及其介導的信號調控通路，進一步闡明成纖維細胞可能分化為汗

2、腺樣細胞的重編程機制，為利用其它多種類型細胞作為汗腺再生種子細胞，為臨床大面積汗腺損傷的患者實現(xiàn)汗腺再生帶來希望。
　　方法:
　　前期研究表明，調控成纖維細胞重編程為汗腺樣細胞關鍵信號通路涉及NF-κB和Lef-1等，結合文獻報道的參與調控胚胎發(fā)育過程汗腺細胞發(fā)生、發(fā)展過程蛋白的變化，尋找出主要的參與調控關鍵轉錄因子NF-κB和Lef-1的基因組合，分析其參與的信號通路網絡，并進一步驗證其生物功能。
　　1.實驗分組

3、與操作程序:待細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，生長密度達到80％以上時，按106個/孔的密度將細胞接種于6孔板后采用完全隨機(完全隨機設計也叫組間設計，被試被分成若干組，每組分別接受一種實驗處理，有幾種實驗處理被試也相應的被分為幾組，各實驗組的被試之間相互獨立，因而又叫“獨立組”設計)將其分為3組(每組的樣本量為5)，①目的基因轉染組:將所構建的含有NF-κB和Lef-1基因的真核表達載體轉染入細胞并篩選出穩(wěn)定表達的單克隆，待后續(xù)實驗使用;②空載

4、體組:將pcDNA3.1(+)空載體轉染細胞并篩選出穩(wěn)定表達的單克隆，待后續(xù)實驗使用;③空白對照組:不轉染目的基因，相同實驗條件下培養(yǎng)。
　　2.NF-κB和Lef-1基因對人成纖維細胞的重編程:
　　2.1真核表達載體的構建:在美國國立生物技術信息中心(National Center ofBiotechnology Information，NCBI)上查找實驗所需人NF-κB和Lef-1的基因序列，根據(jù)所查序列和實驗需要分

5、別設計NF-κB和Lef-1基因開放閱讀框(open reading frame，ORF)PCR引物，用總RNA提取試劑盒提取人成纖維細胞總RNA，進行逆轉錄酶的作用合成目的cDNA，將cDNA和pcDNA3.1(+)載體分別用HindⅢ/SalⅠ及HindⅢ/PstⅠ雙酶切并連接轉化大腸桿菌DH-5α擴增，為了驗證NF-κB和Lef-1目的基因序列是否有突變，將含有重組子的菌液送華大基因測序，選取無突變的單克隆菌液保種，經測序正確后提

6、取質粒，并檢測所提取質粒濃度。
　　2.2轉染細胞并篩選穩(wěn)定表達細胞系:將所培養(yǎng)的細胞以5000個/孔的密度接種于96孔板，用不同濃度的G418培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，以10～14 d殺死全部細胞的濃度為基本濃度，并以此確定篩選濃度和維持濃度。轉染前一天按106個/孔的密度將所培養(yǎng)細胞接種于6孔板，按脂質體轉染的標準程序轉染細胞，轉染48 h后用含G418的培養(yǎng)基按800mg/L的濃度篩選轉染成功的細胞，2周后以200 mg/L的濃度維持

7、篩選壓力，挑選并在96孔板中培養(yǎng)成陽性單克隆，擴大培養(yǎng)將穩(wěn)定轉染的細胞用于后續(xù)實驗。利用Realtime-PCR檢測3組細胞NF-κB和Lef-1的mRNA表達情況。
　　3.NF-κB和Lef-1重編程人成纖維細胞誘導培養(yǎng)后變化:
　　EDA-A1能促進正常和外胚層發(fā)育缺陷小鼠的汗腺、毛囊等外胚層組織器官的發(fā)育，EGF能提高MSCs分化為SGLCs的誘導率。因此，本實驗采用1μg/ml EDA-A1、50 ng/ml EG

8、F加入培養(yǎng)基誘導重編程后的人成纖維細胞分化為SGLCs。
　　3.1汗腺標志物的檢測:應用免疫熒光法鑒定NF-κB和Lef-1重編程人成纖維細胞的汗腺相關分子如CEA，CK7，CK14和CK19等的表達;應用Western blot技術從蛋白層面檢測NF-κB和Lef-1重編程人成纖維細胞的汗腺相關分子CEA，CK7，CK14和CK19等的表達變化;應用Realtime-PCR定量檢測NF-κB和Lef-1重編程人成纖維細胞的汗腺

9、相關分子CEA，CK7，CK14和CK19等的表達變化。
　　3.2 NF-κB和Lef-1通路下游基因的檢測:應用Realtime-PCR定量檢測NF-κB和Lef-1重編程人成纖維細胞的NF-κB和Lef-1通路關鍵下游基因Shh和Cyclin D1的表達變化。
　　3.3裸鼠腳掌移植實驗:應用前期實驗所建立的裸鼠模型探究重編程汗腺樣細胞的功能以及汗腺再生修復作用。將轉染了pcDNA3.1(+)-NF-κB和pc DNA

10、3.1(+)-Lef-1的實驗組成纖維細胞和另外兩組對照組的成纖維細胞以1×106個細胞制成的150μl混懸液用注射器植入裸鼠燙傷后的腳掌，20天后進行組織學檢查和發(fā)汗實驗觀察重編程汗腺樣細胞的生物學功能，并進行安全性評價。
　　結果:
　　1.NF-κB和Lef-1真核表達載體構建:NF-κB和Lef-1基因的基因開放閱讀框(open reading frame，ORF)克隆進pcDNA3.1(+)載體，經HindⅢ/Sa

11、lⅠ及HindⅢ/PstⅠ雙酶切后瓊脂糖電泳分別可見相對分子質量約為3000 bp和1200 bp的條帶，經測序鑒定堿基對無突變，表明成功構建了pcDNA3.1(+)-NF-κB和pcDNA3.1(+)-Lef-1真核表達載體。
　　2.G418篩選及NF-κB和Lef-1表達檢測:G418培養(yǎng)液遞增篩選2周后未轉染成功的細胞全部死亡，維持篩選20 d后形成陽性克隆。
　　Realtime-PCR結果顯示，目的基因轉染組、空

12、載體組、空白對照組的NF-κBmRNA的相對表達量分別為3.651±0.062、0.987±0.098、1.118±0.024，Lef-1 mRNA的相對表達量分別為2.451±0.032、0.997±0.078、1.158±0.043，表明穩(wěn)定轉染的人成纖維細胞的NF-κB和Lef-1 mRNA的表達也顯著增加，與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，與空載體組相比差異也有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，可認為重組載體在細胞內已

13、有較高轉錄水平。
　　3.汗腺標志物的檢測:Western-blot結果顯示，pcDNA3.1(+)-NF-κB和pcDNA3.1(+)-Lef-1轉染組中CEA，CK7，CK14和CK19蛋白均有明顯地表達，而空載體組、空白對照組中均未看見有表達。Realtime-PCR結果顯示，pcDNA3.1(+)-NF-κB和pcDNA3.1(+)-Lef-1轉染組中CEA，CK7，CK14和CK19 mRNA均有明顯地表達，而空載體組、

14、空白對照組中均未看見有表達。免疫熒光染色結果顯示，pcDNA3.1(+)-NF-κB和pcDNA3.1(+)-Lef-1轉染組中CEA，CK7，CK14和CK19熒光亮度很強，而其他兩個對照組相同蛋白的熒光基本上看不見。
　　4.NF-κB和Lef-1通路下游基因的檢測:
　　Realtime-PCR結果顯示，目的基因轉染組、空載體組、空白對照組的ShhmRNA的相對表達量分別為3.151±0.052、0.997±0.038

15、、1.098±0.074，Cyclin D1mRNA的相對表達量分別為2.653±0.045、0.997±0.048、1.118±0.053，表明穩(wěn)定轉染的人成纖維細胞的Shh和Cyclin D1 mRNA的表達也顯著增加，與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，與空載體組相比差異也有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，可認為被公認參加汗腺再生過程中很重要的Shh和Cyclin D1在細胞內已有較高轉錄水平。
　　5.裸鼠腳掌移

16、植實驗:
　　20天后進行的碘淀粉發(fā)汗實驗結果顯示，大約7/10的實驗組腳掌為陽性結果，在腳掌中間可以明顯的看到藍黑色的區(qū)域，而兩組對照則沒有看到相應的陽性結果。組織學檢查發(fā)現(xiàn)，目的基因轉染組的裸鼠腳掌HE染色切片中可以看到有汗腺的再生，基底層汗腺導管相連接，而對照組則沒有發(fā)現(xiàn)汗腺結構的再生。冰凍切片中可看見ck7和ck19的紅色熒光。移植瘤實驗證明了汗腺樣細胞的安全性。
　　結論:
　　NF-κB和Lef-1的基因組

17、合可以直接重編程人成纖維細胞分化成汗腺樣細胞，在誘導成汗腺樣細胞的過程中汗腺特異性標志物CEA，CK7，CK14和CK19的表達有明顯的表達，并且通過檢測通路下游基因Shh和Cyclin D1證實了NF-κB和Lef-1這兩條通路在直接重編程過程中的重要作用。直接重編程后的人成纖維細胞在裸鼠模型中得到了生物學功能的驗證，為利用其它多種類型細胞進行汗腺樣細胞重編程、實現(xiàn)汗腺再生奠定理論基礎，為臨床大面積汗腺損傷的患者實現(xiàn)汗腺再生帶來希望。