1、目的:
　　本課題主要研究了以下內(nèi)容:1、軟骨細胞增殖分化過程中mTORC1通路活性的變化。2、雷帕霉素對軟骨細胞增殖分化的影響。3、軟骨細胞mTORC1通路過度活化對于小鼠軟骨內(nèi)成骨的影響。4、mTORC1通路如何調(diào)控PTHrP來控制軟骨細胞增殖分化。
　　方法:
　　1、體內(nèi)軟骨細胞增殖分化時mTORC1通路活性的變化情況。
　　利用免疫熒光觀察mTORC1通路活性指標蛋白磷酸化核糖體S6蛋白(pS6)在小鼠

2、E14.5天肱骨，以及P7、P18天脛骨中的表達情況。
　　2、雷帕霉素對軟骨細胞增殖分化的影響。
　　繪制不同濃度雷帕霉素處理過后的軟骨細胞的增殖曲線。
　　3、軟骨細胞過度激活的mTORC1通路的軟骨細胞特異性TSC1敲除小鼠的軟骨細胞增殖、分化情況。
　　利用Cre-Loxp系統(tǒng)，我們構(gòu)建出軟骨細胞特異性敲除TSC1基因的小鼠(TSC1CKO)。
　　4、過度激活的mTORC1通路的TSC1CKO小鼠

3、軟骨細胞增殖情況。
　　TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠肋骨切片的HE染色。
　　5、TSC1CKO小鼠表現(xiàn)出肥大分化減慢，終末肥大分化受到抑制。
　　利用原位雜交顯示Col10a1的mRNA在TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠脛骨生長板上的表達情況。
　　6、雷帕霉素可以逆轉(zhuǎn)TSC1CKO小鼠的表型。
　　于出生后第3周開始給予TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flo

4、x小鼠灌服雷帕霉素，繪制其生存曲線，觀察雷帕霉素對TSC1CKO小鼠死亡率的影響。
　　7、TSC1CKO小鼠出現(xiàn)相關(guān)表型的機制研究。
　　利用qPCR分析TSC1CKO小鼠及TSC1 flox/flox小鼠脛骨生長板的IHH、PTHrP、Gli1、 Patched1的mRNA表達水平。
　　8、mTORC1通路下游蛋白S6K1與Gli2相互作用的研究。
　　利用免疫共沉淀方法，檢測S6K1和Gli2、Gli1的

5、相互作用。
　　結(jié)果:
　　1、軟骨分化過程中mTORC1通路活性發(fā)生變化。
　　qPCR證實了ITS培養(yǎng)基的原代軟骨細胞肥大分化增多，出現(xiàn)終末肥大分化的標志蛋白MMP13。同時，免疫熒光染色也顯示了mTORC1活性的變化是由于分化過程中TSC1蛋白的變化所導(dǎo)致的。
　　2、抑制mTORC1活性可以促進軟骨細胞終末分化
　　HE切片分析顯示，給予雷帕霉素后，增殖區(qū)縮短。原位雜交顯示給予雷帕霉素后，小鼠脛骨生

6、長板的MMP13表達增多。Western blots也證實雷帕霉素處理后MMP13表達增多。
　　3、軟骨細胞內(nèi)過度激活的mTORC1通路會導(dǎo)致小鼠軟骨發(fā)育不良。
　　HE切片分析顯示，出生P0天TSC1CKO小鼠的脛骨肥大區(qū)軟骨高度明顯短與同窩對照。出生2W后TSC1CKO小鼠肥大區(qū)高度和同窩對照基本一致，4W、8W、12W的TSC1CKO小鼠，其脛骨肥大區(qū)高度都明顯多于同窩對照小鼠。
　　4、過度激活的mTORC1

7、通路使TSC1CKO小鼠軟骨細胞增殖增加。
　　HE切片分析顯示，TSC1CKO小鼠的肋軟骨細胞中有更多的處在分裂相的軟骨細胞。BrdU免疫熒光顯示，TSC1CKO小鼠的脛骨靜息區(qū)、增殖區(qū)軟骨細胞中的BrdU陽性細胞都明顯多于TSC1flox/flox小鼠，同時在TSC1CKO小鼠的肥大期軟骨中，也發(fā)現(xiàn)有BrdU陽性細胞。結(jié)果說明TSC1CKO小鼠的軟骨細胞增殖增加，甚至在本應(yīng)退出細胞周期的肥大軟骨細胞中也發(fā)現(xiàn)了增殖現(xiàn)象。West

8、ernblots顯示TSC1CKO軟骨細胞的PCNA、Cyclin D1、Cyclin B1表達增高。免疫組織化學(xué)顯示，Cyclin B1表達水平增高，在肥大期軟骨內(nèi)也發(fā)現(xiàn)有Cyclin B1高表達。軟骨細胞的增殖曲線顯示，TSC1CKO的軟骨細胞增殖增加。
　　5、過度激活的mTORC1通路抑制軟骨細胞的成熟分化。
　　原位雜交顯示4周齡的TSC1CKO小鼠的Col10a1的表達區(qū)域高度明顯高于同窩對照。免疫組化顯示TSC

9、1CKO小鼠脛骨生長板的p57KIP2表達水平較同窩對照低。冰凍切片的Von Kossa顯示TSC1CKO小鼠的終末肥大軟骨細胞減少。
　　6、雷帕霉素可以抑制TSC1敲除小鼠的軟骨發(fā)育不良表型的發(fā)生。
　　給予雷帕霉素灌胃后，TSC1CKO小鼠的死亡率減少。Western blots顯示，TSC1CKO小鼠細胞增殖相關(guān)蛋白Cyclin D1、PCNA增加，而分化相關(guān)的蛋白Col10a1、Runx2、MMP13、OPN表達均

10、降低。
　　7、mTORC1通路的活性是PTHrP的分泌過程所需要的。
　　qPCR顯示，TSC1CKO小鼠軟骨組織IHH mRNA表達同對照組沒有差異，而PTHrP、Gli1、Patched1表達均較對照組明顯升高。Western blots顯示Gli1、PTHrP、Patched1表達量增高明顯，而且雷帕霉素可以降低這些蛋白的表達。免疫組化顯示，TSC1CKO小鼠軟骨組織中PTHrP表達明顯升高，且給予雷帕霉素后，PTH

11、rP表達降低。20nM濃度的雷帕霉素能夠抑制TSC1CKO小鼠軟骨細胞的增殖。轉(zhuǎn)染Gli2、S234E質(zhì)粒以及給予雷帕霉素處理后，Western blots顯示Gli2及其激活型突變S234E可以增強PTHrP蛋白表達水平。給予IGF-1因子模擬生理性刺激顯示PTHrP、Gli1、Patched1蛋白表達水平均明顯增加。Luciferaseassay顯示過表達S6K1可以增加PTHrP及Patched1的表達，而給予雷帕霉素可以抑制S6

12、K1的效應(yīng);過表達S6K1+Gli2可以增加PTHrP表達，而同時轉(zhuǎn)染Gli2siRNA可以抵消這種效應(yīng)。給予TSC1 flox/flox小鼠軟骨細胞GDC-0449以及GANT-61，兩者均可抑制其增殖;而在TSC1CKO小鼠軟骨細胞上，GDC-0449不能抑制其增殖。Western blots顯示相比GDC-0449，雷帕霉素仍可抑制Gli1、PTHrP、Patched1的表達。CHIP實驗證明，Gli2和PTHrP啟動子的結(jié)合，T

13、SC1CKO小鼠軟骨細胞中增強，而雷帕霉素可以抑制這種效應(yīng)。
　　8、mTORC1/S6K1通路通過影響Gli2來調(diào)控PTHrP分泌。
　　免疫共沉淀顯示，S6K1同Gli1及Gli2有相互作用，而這種作用在TSC1CKO小鼠軟骨細胞中增強，同時雷帕霉素可以抑制S6K1同Gli1及Gli2的結(jié)合。另一項免疫共沉淀顯示，磷酸化的Gli2在TSC1CKO小鼠軟骨細胞中增多，而雷帕霉素可以抑制Gli2的磷酸化。Western bl

14、ots顯示Gli1、Gli2在TSC1CKO小鼠軟骨細胞中，更多比例的分布在細胞核，表明TSC1CKO小鼠的Gli1、Gli2入核增多，而雷帕霉素亦可以阻止其入核;轉(zhuǎn)染S6K1的ATDC5細胞以及給予IGF-1因子刺激的相關(guān)實驗也證實此現(xiàn)象。免疫共沉淀顯示SuFu與Gli1、Gli2的結(jié)合在TSC1 CKO上減少，表明TSC1敲除影響了SuFu和Gli1、Gli2的結(jié)合。轉(zhuǎn)染Gli2、S234A、S234E的相關(guān)實驗證明，磷酸化位點的有

15、無對于SuFu和Gli2的結(jié)合有影響。轉(zhuǎn)染Gli2、S234A、S234E質(zhì)粒的實驗顯示，激活型S234E能夠增強PTHrP及Gli1表達，而S234A可以一定程度上抑制PTHrP及Gli1表達。轉(zhuǎn)染S6K1過表達質(zhì)粒的實驗證明PTHrP、Gli1的表達均上升。免疫熒光也證實TSC1CKO小鼠軟骨細胞的PTHrP增多，而雷帕霉素可以抑制其表達。免疫熒光實驗也觀察到，TSC1CKO小鼠軟骨細胞的Gli2入核增多。
　　結(jié)論:

16、　　本文利用基因敲除小鼠與細胞模型，探討了TSC1/mTORC1/S6K1信號通路在軟骨發(fā)生中的作用及PTHrP分泌調(diào)控機制:
　　1、軟骨細胞規(guī)律的增殖肥大分化過程中，伴隨著mTORC1通路活性的變化:靜息期軟骨細胞維持一定的mTORC1活性，增殖期及前肥大期軟骨細胞mTORC1活性增高，隨后分化進行時肥大期軟骨細胞mTORC1活性缺失。
　　2、mTORC1抑制劑雷帕霉素可以促進軟骨細胞肥大分化，特別是終末肥大分化。

17、r>　　3、軟骨細胞內(nèi)過度激活的mTORC1使得小鼠出現(xiàn)侏儒表型。主要原因是，軟骨細胞增殖增加，肥大分化減少，終末肥大分化延遲，成骨延遲。而雷帕霉素可以一定程度上逆轉(zhuǎn)這個現(xiàn)象。
　　4、過度激活的mTORC1通路主要通過調(diào)控PTHrP來影響軟骨細胞規(guī)律分化。激活的mTORC1導(dǎo)致PTHrP表達增多。增多的PTHrP使得肥大分化變慢，終末肥大分化及成骨延遲。
　　5、過度激活的mTORC1通路是通過S6K1和Gli2的相互作用

18、使PTHrP表達增多。S6K1使Gli2的S234位點磷酸化增多，抑制SuFu同Gli2的結(jié)合，從而使得Gli2入核增多，使得PTHrP表達增多。
　　至此，本研究不僅證明mTORC1通路活性是伴隨軟骨細胞增殖分化而變化的，而且證明了適當?shù)?、精確調(diào)控的mTORC1通路活性對于軟骨細胞正常的增殖分化來說是至關(guān)重要的。而且我們闡明了mTORC1是如何調(diào)控PTHrP分泌來控制軟骨細胞的規(guī)律分化這一新機制。本研究為了解軟骨細胞發(fā)育分化提供