1、目的：本實驗探討應用RNA干擾（RNA Interference, RNAi）技術下調纖溶酶原激活抑制劑-1（Plasminogen Activator Inhibitor-1，PAI-1）表達對SD大鼠皮膚成纖維細胞（fibroblast）增殖的影響，通過體外實驗從細胞水平探究 PAI-1對成纖維細胞增殖、轉化的作用，進一步為前期動物實驗 PAI-1 siRNA可改善 SD大鼠瘢痕疙瘩模型提供理論依據，為瘢痕疙瘩（keloid）基因治

2、療開辟新思路。
　　方法：
　　1.SD大鼠皮膚成纖維細胞培養(yǎng)
　　采用組織塊培養(yǎng)法獲取原代 SD大鼠皮膚成纖維細胞，經傳代培養(yǎng)去除上皮細胞、紅細胞等雜質成分，獲取單一成纖維細胞，倒置顯微鏡下觀察細胞生長及形態(tài)變化。
　　2.免疫細胞化學法鑒定細胞
　　應用免疫細胞化學法，通過檢測波形蛋白表達是否陽性，鑒定所培養(yǎng)的細胞是否為成纖維細胞。
　　3.PAI-1 siRNA轉染至體外培養(yǎng)的成纖維細胞，并進行

3、實驗分組
　　利用脂質體（Lipofectamine2000）轉染 siRNA至體外培養(yǎng)傳代至第六代的成纖維細胞，根據轉染不同設置實驗分組為：轉染 PAI-1 siRNA的實驗組、轉染 NC siRNA的陰性對照組、不進行轉染的空白對照組。
　　4.應用RT-PCR法檢測轉染24小時，PAI-1 mRNA、TGF-β1 mRNA的表達。
　　5.應用 Western blot法測定轉染48小時，PAI-1、AKT、ER

4、K、p-AKT、p-ERK蛋白的表達。
　　6.應用臺盼藍染色法計數細胞并繪制曲線。
　　分別于轉染24小時、48小時、72小時，制備細胞懸液進行臺盼藍染色，鏡下計數細胞總數以及未被染液染色的細胞總數（或被染色的細胞總數），以培養(yǎng)時間為橫坐標，細胞計數為縱坐標，繪制成纖維細胞生長曲線及成纖維細胞成活率曲線。
　　7.應用CCK-8測定成纖維細胞的增殖活力繪制曲線。
　　分別于轉染24小時、48小時、72小時加入C

5、CK-8試劑，孵育4小時后，通過使用酶聯(lián)免疫檢測儀測定吸光度（OD值），根據計算公式，得出細胞的OD值、細胞增殖抑制百分率（％）。以培養(yǎng)時間為橫坐標，細胞的OD值為縱坐標繪制生長曲線；以培養(yǎng)時間為橫坐標，細胞增殖抑制百分率（%）為縱坐標繪制增殖抑制率曲線。
　　8.統(tǒng)計學處理
　　本實驗所有數據應用 SPSS21.0統(tǒng)計軟件，實驗數據為計量資料，采用均數±標準差表示，統(tǒng)計結果以 P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。進行數據分析

6、之前，先分析數據的正態(tài)性和方差齊性。若數據服從正態(tài)性分布且方差齊時，則多樣本比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間比較采用 SNK-q檢驗；若不服從正態(tài)性分布或方差不齊，則選用秩和檢驗中的Kruskal-Wallis H檢驗，組間比較采用 Mann-Whitney U檢驗。
　　結果：
　　1.采用組織塊培養(yǎng)法成功獲取 SD大鼠皮膚成纖維細胞，經傳代至第5-6代可獲取單一成分的成纖維細胞；
　　2.

7、采用免疫細胞化學法染色檢測波形蛋白，鏡下可見培養(yǎng)細胞胞漿顯示棕色或棕黃色顆粒，細胞核未見著色，即波形蛋白抗體染色陽性，證實實驗所培養(yǎng)細胞是成纖維細胞；
　　3.應用 Real time PCR檢測 PAI-1成功轉染成纖維細胞，成纖維細胞中 PAI-1 mRNA、 TGF-β1 mRNA表達明顯降低，三組間 RQ值總體均數不同或不全相同（P＜0.05），實驗組與陰性對照組間、實驗組與空白對照組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而

8、陰性對照與空白組間無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；
　　4.應用 Western blot檢測成功轉染 PAI-1 siRNA，成纖維細胞中PAI-1、p-AKT、p-ERK蛋白的表達明顯下調，實驗組與陰性對照組間、實驗組與空白對照組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而陰性對照與空白組間無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；而對去磷酸化狀態(tài) AKT、ERK無影響，三組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；
　　5.臺盼藍染色后計數細

9、胞，繪制成纖維細胞生長曲線及成活率曲線可見隨著時間進展轉染 PAI-1 siRNA后成纖維細胞數量增長速度較陰性對照組與空白對照組明顯減慢，細胞成活率顯著降低；
　　6.采用 CCK-8試劑測定繪制成纖維細胞生長曲線及成纖維細胞增殖抑制率曲線，觀察走勢，與對照組相比可見轉染 PAI-1 siRNA后的成纖維細胞增殖活力低，增殖抑制率較高。
　　結論：
　　本實驗研究成功獲取原代 SD大鼠皮膚成纖維細胞，選取傳代至第五或